상동 재조합을 통한 시아노박테리아에서 항생제 표시 돌연변이체의 생성

시아노박테리아 배양으로 시작하십시오.

배양물을 원심분리한 다음 펠릿을 부드럽게 세척하여 박테리아 표면 필리를 보존합니다.

다시 원심분리하고 펠릿을 신선한 배지에 재현탁한 다음 튜브로 옮깁니다.

항생제 내성 유전자를 가진 비복제 벡터를 도입합니다. 이 유전자 옆에는 박테리아 게놈에서 표적 유전자의 상류 및 하류에 위치한 영역과 상동적인 DNA 서열이 있습니다.

상동 서열과 정렬되고 재조합을 통해 표적 유전자를 대체하여 돌연변이를 도입하는 플라스미드의 필리 매개 내재화를 허용하도록 배양합니다.

한천에 세포를 퍼뜨리고 배양하여 항생제 내성 유전자가 내성 단백질을 발현할 수 있도록 합니다.

항생제가 함유된 한천으로 한천 표면을 덮고 배양합니다. 돌연변이 세포의 내성 단백질은 항생제를 비활성화하여 생존과 콜로니 형성을 촉진합니다.

살아남은 콜로니를 선택하고 항생제 내성 돌연변이를 분리하기 위해 항생제가 포함된 한천에 다시 줄무늬를 만듭니다.

배지를 준비한 후, 시아노박테리아 균주 및 플라스미드는 텍스트 프로토콜에 따라 시아노박테리아 세포로 가득 찬 루프를 30-50밀리리터의 BG11 배지에 접종하여 신선한 배양을 설정합니다.

섭씨 30도의 빛에서 2-3일 동안 배양액을 OD₇₅₀ 0.2에서 0.6으로 성장시킵니다.

배양 후, 1-2밀리리터의 배양액을 2,300g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버린 후 BG11 배지를 사용하여 펠릿을 한 번 세척하고 소용돌이가 DNA 흡수에 필수적인 필리의 손실을 초래할 수 있으므로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.

세포를 다시 펠릿화하고 상청액을 제거한 후, BG11 배지를 100마이크로리터의 최종 부피까지 첨가하고 세포를 14밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 이전에 준비된 플라스미드 A 1마이크로그램을 세포에 넣고 부드럽게 두드려 혼합합니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 30도의 인큐베이터에 수평으로 놓고 4-6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 항생제 없이 BG11 한천 플레이트에 세포 배양 플라스미드 DNA 혼합물의 분취량을 펴고 섭씨 30도에서 배양합니다.

약 24시간 후, 카나마이신이 함유된 물에 0.6% 한천 용액을 준비하고 섭씨 42도까지 식힙니다. 그런 다음 배양판의 가장자리에 2.5-3밀리리터를 첨가하고 판을 기울여 용액이 표면에 균일한 상단 한천층을 형성하도록 합니다.

콜로니가 보이도록 플레이트를 약 7일 동안 배양합니다. 그런 다음 신선한 BG11 한천과 카