재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

JoVE Encyclopedia of Experiments

미생물학

0 조회수 • 2:54 분 • November 28th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폴리히스티딘 표지된 표적 단백질을 발현하는 박테리아 세포의 현탁액을 생각해 봅시다.

단백질 분해를 최소화하기 위해 얼음 위에 초음파 처리하세요. 고주파 음파가 세포를 용해시켜 세포 내 내용물을 방출하며, 표적 단백질도 포함됩니다.

원심분리기를 통해 이물질을 분리하고 상원액이 포함된 단백질을 주사기로 옮깁니다.

상청액을 여과하여 응집체를 제거하고 크로마토그래피 컬럼의 막힘을 방지합니다.

니켈 기반 친화성 크로마토그래피 컬럼을 가져와 최적의 단백질 정제를 위해 평형을 맞춥니다.

여과액을 컬럼에 적재하세요. 폴리히스티딘 태그는 컬럼 수지의 니켈 이온에 결합하여 표적 단백질을 고정시킵니다.

버퍼로 컬럼을 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거하고, 용출액의 UV 흡수 상태를 모니터링하여 비표적 단백질이 제거되었는지 확인합니다.

이미다졸이 포함된 용출 완충제를 추가하는데, 이 완충제는 폴리히스티딘 태그와 경쟁하여 니켈 결합을 하여 단백질을 방출합니다.

두 번째 UV 흡수율 급증은 표적 단백질의 용출을 확인시켜 후속 사용 준비가 완료됩니다.

얼음 위에 있는 세포를 15초 펄스와 30초 정지로 5회 사이클로 초음파 처리합니다.

세포 용해액을 21,000g 4도 섭씨에서 15 분간 원심분리한 후, 멸균 주사기 필터 시스템으로 상청액을 여과합니다. 5밀리리터 니켈 기반 친화성 컬럼이 장착된 자동 정제 시스템을 사용하여 멸균된 대장균 상청액에서 HIS 태그가 부착된 RTA 분획을 정제합니다. 일반적으로 분당 1밀리리터의 용출 속도를 사용하고, 비효율적인 독소 결합과 독소 활성 손실을 방지하기 위해 전체 정화 시스템을 냉각하세요.

친화성 컬럼을 20밀리리터의 결합 버퍼로 잠시 평형으로 만들어 저장 버퍼를 제거하세요. 그 후 무균 여과된 상청액을 주사기로 친화성 컬럼에 바릅니다. 컬럼을 25에서 35밀리리터 결합 완충제로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

세척 과정을 280나노미터에서 UV 흡수율이 초기 UV 값에 가까워질 때까지 반복합니다. 그 후 결합된 RTA 분획을 20에서 35밀리리터의 용출 버퍼로 용출하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다. UV 280 값이 증가한 직후에 RTA 분획 샘플링을 시작하고, 원래 기준선에 도달하면 RTA 분획 샘플링을 중단하는 것이 중요합니다.

09:54

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

관련 동영상

0 조회수

05:35

고정화 금속 친화성 크로마토그래피에서 금속 침출정 정량화

관련 동영상

0 조회수

07:19

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

관련 동영상

0 조회수

10:32

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

관련 동영상

0 조회수

07:44

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

관련 동영상

0 조회수

02:59

음이온 교환 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 순 전하를 기준으로 투석된 박테리아 용해물에서 관심 단백질을 분리하는 분리 기술

관련 동영상

0 조회수

03:54

니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

관련 동영상

0 조회수

03:03

단클론 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 기법

관련 동영상

0 조회수

06:03

Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

관련 동영상

0 조회수

11:22

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

관련 동영상

0 조회수

마지막 업데이트: 1 8월 2026