JoVE 실험 백과사전
미생물학
0 조회수 • 3:09 분 • November 28th, 2025
유전공학적으로 배양된 대장균 에서 염색체 테트라사이클린 연산자(tetO) 배열을 발현한 경우를 생각해 보십시오.
박테리아는 또한 YFP 표지된 테트라사이클린 억제 단백질의 발현을 유도하는 아라비노스 유도 프로모터를 가진 플라스미드를 보유하고 있습니다.
배양물을 항생제가 포함된 농축된 영양 배지로 옮기고, 진동시키며 플라스미드 보유 세포를 선별하여 배양합니다.
세포가 성장함에 따라 플리시좀이 형성되어 염색체 DNA 복제를 시작합니다.
지수 위상에서는 유도되지 않은 대조군으로 일부를 수집합니다.
남은 배양에 유도제인 아라비노스를 추가하고 두 배양균을 쉐이핑으로 배양하세요.
유도되지 않은 배양에서는 AraC 다이머가 DNA 루프에 결합되어 억제제 발현을 억제합니다.
유도 배양에서 아라비노스는 AraC 다이머에 결합하여 억제자 발현을 유도합니다.
억제 단백질은 염색체 tetO 배열에 결합하여 복제 포크 진행을 멈춥니다.
형광 현미경을 사용해 두 배양 모두를 관찰하세요.
유도된 대장균 배양에서 형광 초점은 억제자 단백질 매개 복제 차단을 확인한다.
이 절차에는 pKM1 플라스미드 내에 테트라사이클린 연산자 배열을 가진 대장균 주가 사용됩니다. pKM1은 유도성 노란색 형광 단백질 표지인 테트라사이클린 억제 단백질인 TetR-YFP를 암호화합니다.
이 E. coli 균의 신선한 배양물을 600나노미터 0.01의 광학 밀도로 희석하여 선별에 필요한 항생제를 투여합니다. 배양물을 30도 섭씨에서 흔들어 600나노미터 광밀도 0.05에서 0.1까지 키웁니다. 유도되지 않은 대조군으로 사용할 10밀리리터 샘플을 제거하세요.
남은 배양물에 0.01%의 아라비노스를 첨가하여 pKM1에서 TetR-YFP를 유도합니다. 30도 섭씨에서 진동하며 유도 및 유도 배양 모두를 계속 배양하세요. 1시간 후에는 형광 현미경을 이용해 유도 배양 세포 내 단일 초점점이 있는지 확인합니다.
유도 세포가 차단된 것으로 확인되면, 단일 초점을 가진 세포가 70% 이상임을 나타내며, 광학 밀도를 기록하고 샘플의 7.5밀리리터를 추출하여 2차원 겔 전기영동으로 분석합니다. 유도되지 않은 대조군 배양에서 동등한 샘플을 제거하세요.