형광 생체분자를 박테리아 세포에 전기천공 기반 전달

먼저 막 투과에 더 민감한 전기적(electro-competenable bacterial) 세포가 현탁된 차가운 큐벳으로 시작하세요.

현탁액에는 유기 형광체가 표지된 생체분자도 포함되어 있습니다.

고전압 전기 펄스를 가해 임시 막 구멍을 만들어 생체분자가 세포질에 침투할 수 있게 합니다.

영양분이 풍부한 배지를 추가하고 세포를 튜브로 옮깁니다. 양막 수리를 촉진하기 위해 인큐베이팅하세요.

세포를 원심분리한 후, 내부화되지 않은 생체분자가 포함된 상원액을 버립니다.

표면에 부착된 생체분자를 분리하기 위해 세제가 포함된 고염 완충제에 세포를 재현탁합니다.

다시 원심분리기로 돌려 상청액을 버리고 세포를 버퍼 안에 다시 부유시킵니다.

현탁액을 필터와 원심분리기로 옮겨 내부화되지 않은 생체분자를 포함한 흐름 부속물을 버립니다. 그 후 세포를 신선한 완충제로 헹군 후 다시 부유시킵니다.

세포를 아가로스 패드에 부착하고 커버슬립을 놓으세요. 형광 표지된 박테리아는 시각화 준비가 되었습니다.

저이온 강도 완충제에서 준비한 형광 생체분자 재고를 시작으로, 최대 5마이크로리터의 생체분자를 20마이크로리터 용량의 유능한 박테리아 또는 50마이크로리터의 유능한 효모 세포 알리코트로 옮깁니다. 세포와 함께 배양된 형광 생체분자의 양은 전기천공 후 세포당 내화되는 생체분자의 양과 직접적으로 상관관계가 있습니다.

혼합물을 얼음 위에 최대 10분간 부화시키세요. 동시에 적절한 전극 간격의 전기포레이션 쿠벳을 선택하고 얼음 위에 식히세요. 셀 혼합물을 미리 차갑게 보관한 쿠벳에 옮기세요.

큐벳을 몇 번 부드럽게 두드려 용액에서 기포를 제거하세요. 종이 타월로 큐벳의 수분을 제거한 후 전기포공기에 넣으세요. 셀에 고전압 펄스를 가하세요.

이 과정을 마치고 전기포공기에 표시되는 시간 상수가 4밀리초에서 6밀리초 사이인지 확인해 보세요. 시간 상수가 낮아지는 이유는 종종 쿠벳 내에 과도한 염분이나 기포가 존재하기 때문이며, 이는 생체분자의 세포 흡수를 감소시키거나 완전히 억제할 수 있습니다. 더 높은 전압 펄스는 셀 부하를 개선하지만, 셀의 생존력에도 영향을 줄 수 있습니다.

전기천공 직후 500마이크로리터의 풍부한 배지를 추가하고 세포를 신선한 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포막을 회복시키기 위해 박테리아는 37도 섭씨, 효모는 29도 섭씨에서 2분에서 10분 정도 배양합니다. 생체분자가 도입되고 성장이 회복된 후, 4도 섭씨의 사전 냉각 원심분리기에서 세포를 1