Myxococcus xanthus 샘플의 생세포 영상 제제

먼저 성장이 느린 토양 박테리아인 Myxococcus xanthus 배양부터 시작하세요.

군집을 항생제를 보충한 배지에 접종하세요.

세포들은 항생제에 저항하도록 설계되어 원하는 박테리아만 생존하도록 보장합니다.

현탁액을 배지를 담은 더 큰 플라스크에 옮기고, 최적의 성장을 촉진하기 위해 흔들면서 배양합니다.

금속 프레임에 부착된 커버슬립을 예로 들어, 영상 촬영 시 기계적 지지를 제공합니다.

박테리아 배양물을 분사한 후, 여러 이미지를 획득하는 동안 이미지 정렬의 기준점으로 형광 미세구를 추가합니다.

미리 데워둔 아가로스 패드를 넣은 배지를 놓고, 수분 유지를 위해 커버슬립을 덮어주세요.

세포가 아가로스 패드에 달라붙도록 배양하세요.

이 패드는 세포에 영양분을 공급하여 느리게 성장하는 박테리아의 증식 과정에서 세포 과정을 장기간 생세포 영상으로 관찰할 수 있게 합니다.

먼저, 1% CTT 500마이크로리터에 단일 M. xanthus 군락을 항생제를 보충한 채 멸균된 튜브에 재현탁한 후, 전체 현탁액을 5밀리리터 1% CTT 5밀리리터가 든 Erlenmeyer 플라스크로 옮깁니다. 1% 아가로스 현미경 용액을 0.2% CTT 함유 1g과 80밀리리터 TPM 버퍼 및 20밀리리터 1% CTT 매개체를 혼합하여 준비합니다. 용액을 전자레인지에 돌려 아가로스가 녹아올릴 때까지 가열하세요.

페트리 접시에 약 60밀리리터의 녹인 아가로스를 채우고 실온까지 식히세요. 사용 전 최소 15분 동안 32도 섭씨에서 아가로스 패드를 예열하세요. 다음으로, 중간에 구멍이 뚫린 플라스틱 또는 금속 프레임에 멸균 유리 커버를 올려놓습니다. 그 다음 테이프로 커버슬립을 프레임에 고정하세요.

커버슬립에 10에서 20마이크로리터의 기하급수적으로 성장한 M. xanthus 세포를 추가하세요. 형광 미세구를 세포의 기준 마커로 추가하려면 TPM 버퍼를 사용해 미세구를 1:100으로 희석합니다. 비드 현탁액을 완전히 흔들고 셀에 5에서 10마이크로리터를 추가하세요.

미리 예열된 1% 아가로스 패드에서 커버 슬립 크기 정도의 작은 패드를 잘라내어 세포 위에 올려놓습니다. 그 후 패드 위에 덮개 슬립을 올려 증발을 방지하고 세포를 습한 환경에 유지하세요. 현미경 샘플을 32도 섭씨에서 15분에서 20분 정도 배양하여 세포가 아가로스 패드 바닥에 부착되도록 한 후 타임랩스 현미경 기록을 진행합니다.