유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

본 절차의 전반적인 목적은 인슐린 노출에 반응하여 포유류 세포의 세포막으로 이동하는 GLUT4 전위를 검출하는 것입니다. 소낭 내에만 GLUT4 단백질을 보유하고 있는 혈청 기아 상태의 근아세포를 먼저 24웰 배양 접시에 분주합니다. 그 후 GLUT4의 외부 에피토프에 대한 항체를 형광 결합 2차 항체와 함께 사전 배양하여 세포에 첨가하고, 이어서 인슐린을 처리합니다.

세포 표면의 인슐린 수용체가 활성화되면 GLUT4가 세포질에서 혈장막 표면으로 이동합니다. 이후 배지 내의 항체가 GLUT4를 인식하게 됩니다. 이 시점에서 세포를 고정하고 유세포 분석법을 통해 형광 염색 강도를 측정할 수 있습니다.

이 방법은 glut4 전위 및 포도당 대사를 연구하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 막 표면의 CD107A 노출을 통한 NK 세포 탈과립과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차에서는 활발하게 성장 중이거나 60~80% 정도 합류(confluent)된 상태에서 하룻밤 동안 혈청 기아(serum starved) 상태를 유지한 세포를 사용하는 것이 중요합니다. 트립신으로 세포를 수확한 후, 세척하고 일반 성장 배지로 재현탁하여 24-well 플레이트의 웰당 500 µL에 0.1 million cells가 되도록 분주합니다. 그 후, 세포가 트립신으로부터 회복될 수 있도록 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

그동안 1차 항 glute four 항체와 Alexa Fluor 4 8 8 결합 2차 chicken antigo IgG 항체를 5:1 비율로 혼합하고, 웰당 10 µL의 항체 혼합액이 사용됨을 고려하여 필요한 최종 부피를 계산하십시오. 항체 혼합액을 실온의 암소에서 10분 동안 배양하십시오. 항체 혼합액이 배양되는 동안, 인슐린을 성장 배지로 희석하여 원하는 농도의 2배 농축 작업액(working stock)을 준비하십시오.

세포를 1시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 꺼냅니다. 세포가 들어 있는 각 웰에 항체 용액 10 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 최소 한 개의 웰은 염색하지 않은 상태로 남겨두십시오.

이 음성 대조군은 이후 유세포 분석기를 설정하는 데 사용됩니다. 다음으로, GLUT4의 세포 표면 전위를 유도하기 위해 각 웰에 2배 농도의 인슐린 스톡 500 µL를 첨가하고, 플레이트를 37 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼낸 후, 각 웰에 1% PFA가 포함된 PBS 1 mL를 첨가하여 세포를 고정하고, 상온의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 셀 리프터를 사용하여 고정된 세포를 웰 바닥에서 조심스럽게 떼어내어 각 웰의 세포를 개별 FACS 튜브로 옮깁니다.

튜브를 원심분리하여 세포를 펠렛화한 다음, 볼텍싱하고 1 mL의 PBS에 재부유시켜 세포를 세척하고 다시 원심분리하며, 이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 세척 단계 사이마다 상층액을 제거합니다.

마지막으로 세척된 세포를 400 µL의 PBS 1%PFA에 재부유합니다. 이제 유세포 분석기를 통해 glute four의 표면 발현을 분석할 수 있습니다. 샘플을 가지고 유세포 분석기에 도착하면, 염색되지 않은 대조군부터 데이터 획득을 시작하십시오.

전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 사용하여 넓은 생존 세포 게이트(live cell gate)를 설정합니다. 그다음, 히스토그램의 여백 내에 음성 피크(negative peak)가 나타나도록 FL1 채널의 전압 설정을 조정합니다. 이러한 파라미터 설정이 완료되면, 튜브당 최소 10,000개의 생존 이벤트(live events)를 기록하며 각 실험 샘플을 분석합니다.

이 히스토그램은 0, 1, 10 또는 100 nM 인슐린에 노출된 근모세포의 표면 GLUT4 염색 상향 조절을 보여줍니다. 이와 대조적으로, 인슐린 저항성이 있는 개인의 근모세포는 100 nM 인슐린에 반응하여 GLUT4를 상향 조절하지 못합니다. 자극된 세포의 평균 형광 강도를 자극되지 않은 세포의 강도로 정규화하면, 건강한 근모세포와 인슐린 저항성 근모세포의 MFI를 직접적으로 비교할 수 있습니다.

이 절차를 사용하여, 혼합 집단 내에서 서로 다른 세포 하위 집단을 식별하기 위해 추가적인 표면 또는 세포 내 마커를 염색할 수 있습니다.