Name: 유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 학습하세요 유동세포계측법을 이용한 GLUT4 플라즈마 막 이동 정량화 방법을 배워보세요. 이 기술은 인슐린 반응성 및 대사 질환 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 작품은 부인의 클리포드 엘더 화이트 그레이엄의 보조금에 의해 지원되었다 LTT하는 NIH (AR052791, AR044387 - 아라, &amp; NS063298)에서, CB 연구 기금 &amp; NIH (AR059838)를 둘러 싸인하고, 의학 Cytometry의 베일러 대학에서 NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, &amp; NCI P30CA125123)에서 자금 코어 정렬과 셀. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 세포 스테 이닝 <ol><li> 셀을 준비합니다. 아직 적극적으로 (- 80 % 코플루엔스 60) 성장하는 동안 세포를 사용해야합니다. 혈청은 인큐베이터에서 24 잘 플레이트와 장소에서 0.5 ML 혈청없는 중간에 하루 잘 당 0,100,000에 판 이들 세포를 세포를 굶어 (37 ° C, 5 % CO 2) 30 분 - 복구 ~ 2 시간 trypsinization에서. </li><li> 기본 및 보조 항체를 섞는다. 믹스 (AlexaFluor 488에 복합 1 μL 보조 닭고기 방지 염소 IgG 항체와 기본 방지 GLUT4 항체의 5 μL) 웰스의 X 숫자. 어둠 속에서, 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 중간에 diluting에 의해 인슐린의 2X 작동 재고를 준비합니다. </li><li> 세포가 준수하거나하지 않은 경우 확인하십시오. </li><li> 부드럽게 세포를 포함하는 우물에 인슐린의 2X 작업 주식 6 μL 항체 믹스와 0.5 ML를 추가합니다. 매체의 난기류를 피하십시오. 알을 품다 (37 ° C 5 % CO 2) 30 분, 어둠 인치 </li><li> 세포를 떨지 않고, 각 잘하는 PBS + 1% PFA 0.5 ML를 추가하여 세포를 수정. 어둠 속에서, 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 당신의 세포가 우물을 준수있다면, 부드럽게 세포 리프터 그들을 리프트. 귀하의 흐름 cytometer에 맞게 및 펠릿 세포 원심 튜브에 세포를 (1 ML 합계) 전송. </li><li> 0.4 ML PBS 1 ML PBS와 resuspend로 두 번 펠렛 + 1퍼센트 PFA 씻으십시오. 이 시점에서, 세포는 호일에 싸여 수 있으며 냉장고에 보관 (4-8 ° C) 또는 즉시 데이터 수집에 대한 흐름 cytometer로 이동합니다. </li></ol> 2. 데이터 수집 <ol><li> 사이드 분산형 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FCS) 패널에서 살아있는 세포 주변 브로드 게이트를 설정합니다. 귀하의 FL1 매개 변수를 설정하는 부정적인 튜브 (세포가 인슐린이나 isotype 컨트롤과 함께 "스테인드"세포로 치료되지 않음) 사용합니다. 당신의 정상이 패널에서 완벽 하단 측면에 상처하지 않도록하십시오. </li><li> 튜브 당 최소 10,000 세포에서 데이터를 수집. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> SSC VS FSC 패널 (그림 1A)에서 살아있는 세포 주위에 게이트를 그립니다. AlexaFluor 488 형광 강도를 비교 라이브 세포 게이트 내의 세포 (그림 1B)의 숫자의 histograms에 플롯. 당신은 차이를 시각화하기 위해 다른 histograms을 오버레이하지만 quantitation 위해 각 셀에 인구에 대한 의미와 평균 형광 강도를 결정하고 비교 (그림 1C) 이러한 숫자를 사용할 수 있습니다. </li><li> 같은 인물 1C 및 1D에 표시된 인슐린의 부재에서 얻어진 값, 데이터를 정상화. </li></ol> 4. 대표 결과 건강한 개인 (NO 인슐린 저항)에서 고립 myoblasts에서 인슐린은 플라즈마 막 (그림 1, 왼쪽)으로 세포질에서 GLUT4의 복용 종속 translocation을 유도. 반대로, 인슐린은 인슐린 저항 (그림 1, 오른쪽)와 함께 환자의 격리 myoblasts의 플라즈마 막에 GLUT4 translocation을 유발하지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 염색법 실험의 예. 에 Myoblasts가 인슐린 저항없이 기증자 (왼쪽)로부터 인슐린 저항 (오른쪽)와 함께 환자에서 고립되었다. 살아있는 세포 주위에 게이트가있는 A, SSC (사이드 분산형) 대 FCS (전진 분산형) 플롯. B, 세포는 게이 티드 A, GLUT4의 외부 에피토프에 대한 항체 물들일하고, unstimulated (적색) 또는 인슐린 1 NM (파란색), 10 NM (오렌지), 또는 100 nm의 (녹색)과 자극 떠났다. 그림의 지혜로움에 대해, 우리는 인슐린 저항과 전지 100 NM의 인슐린없이 데이터를 표시합니다. C는 B에 표시된 histograms의 형광 강도 (MFI) 세포의 MFI에 표준되었습니다 (NO 인슐린) unstimulated 왼쪽을 뜻합니다. D는 histograms에서 표준 MFI 데이터의 음모는 B.에 표시

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 quantifying에 대한 신속한 기술을 증명하고있다. GLUT4는 transiently 세포의 플라즈마 막에서 표현하고 endocytosed입니다. 바운드 항체도 endocytosis 동안 GLUT4에 연결된 상태 때문에, 형광 신호가 인슐린의 존재에 부화의 선택한 기간 동안 플라즈마 막에 노출되었다 GLUT4의 총 금액을 제공합니다. 이 기술은 또한, 플라즈마 막에 세포내 구획에서 다른 단백질의 translocation을 연구에 적용할 관심의 단백질의 외부 에피토프로 이동 좋은 항체 사용할 수 있습니다 제공될 수 있습니다. 예를 들어, 비슷한 분석은 이제 일반적으로 4,5 자신의 플라즈마 막에 CD107a의 translocation을 측정하여 세포 독성 T의 lymphocytes 자연 킬러 lymphocytes의 degranulation의 속도를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 apoptosis 또는 괴사 동안 바깥쪽으로 플라즈마 막의 안쪽에서 phosphatidylserine의 translocation도 형광단 - 라벨 Annexin V 6을 사용, 유동세포계측법에 의해 감지하실 수 있습니다. 분석의 인텔리 게다가, 유동세포계측법 혼합 세포 집단에서 플라즈마 막에 단백질 translocation 연구를 허용 장점을 제공합니다. 사실, 하나는 세포 집합 표시 및 멀티 레이저 흐름 cytometer 7 데이터 수집 다음 ​​관심의 단백질에 대한 얼룩을 결합할 수 있습니다. 프로토콜의 단락 1.2 주어진 항체의 금액은 출발점되며 우리는 당신이 당신에게 최대 신호를 제공하는 최소 항체 농도를 결정하기 위해 관심의 세포와 항체를 적정하다하는 것이 좋습니다. 우리가 사용한 주요 안티 - 인간 GLUT4 항체에 대한 좋은 시작 범위 튜브 당 1-10 μL (튜브 당 즉 0.2-2 μg 항체), 더 이상 백만 이상의 세포를 포함하는 각각의 튜브 것입니다. 다른 차 항체 들어, 공급 업체의 지침을 참조하십시오. 세포의 autofluorescence은 기증자로부터 기증하고 실험에서 실험을 다양하므로 데이터의 정상화가 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-human GLUT4 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>GLUT4의 외부 에피토프 대상</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 접합 Chicken anti-goat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>셀 리프터</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>웰 크기에 맞게 절단하여 사용</td></tr><tr><td>FACS용 5 ml 튜브</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>모든 BD 기기 호환</td></tr></tbody></table>

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 glut4 translocation의 양적 측정

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

포도당은 혈액 농도의 지속적인 규제를 요구, 신체 에너지의 주요 원천입니다. 췌장에서 인슐린 릴리스는 인슐린에 민감한 조직, 특히 뇌, 골격근, 그리고 adipocytes에 의해 포도당 이해를 유도. 타입 2 당뇨병 및 / 또는 비만의 고통 환자는 종종 인슐린 저항을 개발하고 그들의 포도당 항상성를 제어하는​​ 수 없습니다. 인슐린 저항의 메커니즘에 새로운 통찰력은 유형 2 당뇨병에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다. 포도당 전송기의 GLUT 가족은 신체 전반에 걸쳐 하나 다른 조직에 분산 열세 명의 회원으로 구성되어 있습니다. 포도당 수송 유형 4 (GLUT4)는 주요 전송기는 같은 골격근과 같은 인슐린에 민감한 조직에 의해 mediates 포도당 이해되는. 의 수용체에 인슐린의 결합되면, GLUT4는 포도당 이해를 유도, 플라즈마 막으로 세포질에서 이동시키다 포함 vesicles. 감소 GLUT4 translocation 형 - 2 당뇨병 2,3에서 인슐린 저항의 원인 중 하나입니다. 세포질에서 플라즈마 막에 GLUT4의 translocation이 형광단 - 복합 GLUT4 특정 항체를 사용, immunocytochemistry에 의해 시각하실 수 있습니다. 여기, 우리는 유동세포계측법를 사용하여 선택한 기간 동안 세포의 플라즈마 막에 GLUT4 translocation 총 금액을 수치 기법을 설명합니다. 이 프로토콜은 빠른 속도이다 (인슐린과 부화를 포함한 미만 4 시간)과 하나의 실험에서 3000 셀 또는 조건마다 많은 백만으로 세포 같이 몇 가지의 분석을 수 있습니다. 그것은 전송기의 외부 에피토프로 이동 방지 GLUT4 항체에 의존되는 즉시이 플라즈마 막에 translocation 후 세포 매체 노출로에 바인딩.

이 프로토콜은 유동세포계측법에 의해 세포의 플라즈마 막으로 세포질에서 GLUT4의 translocation을 수치 빠른 방법을 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

포도당은 신체의 주요 에너지원으로, 혈중 농도를 지속적으로 조절해야 합니다. 췌장에서 분비되는 인슐린은 ...을 유도합니다.

본 절차의 전반적인 목적은 인슐린 노출에 반응하여 포유류 세포의 세포막으로 이동하는 GLUT4 전위를 검출하는 것입니다. 소낭 내에만 GLUT4 단백질을 보유하고 있는 혈청 기아 상태의 근아세포를 먼저 24웰 배양 접시에 분주합니다. 그 후 GLUT4의 외부 에피토프에 대한 항체를 형광 결합 2차 항체와 함께 사전 배양하여 세포에 첨가하고, 이어서 인슐린을 처리합니다.세포 표면의 인슐린 수용체가 활성화되면 GLUT4가 세포질에서 혈장막 표면으로 이동합니다. 이후 배지 내의 항체가 GLUT4를 인식하게 됩니다. 이 시점에서 세포를 고정하고 유세포 분석법을 통해 형광 염색 강도를 측정할 수 있습니다.이 방법은 glut4 전위 및 포도당 대사를 연구하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 막 표면의 CD107A 노출을 통한 NK 세포 탈과립과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차에서는 활발하게 성장 중이거나 60~80% 정도 합류(confluent)된 상태에서 하룻밤 동안 혈청 기아(serum starved) 상태를 유지한 세포를 사용하는 것이 중요합니다. 트립신으로 세포를 수확한 후, 세척하고 일반 성장 배지로 재현탁하여 24-well 플레이트의 웰당 500 µL에 0.1 million cells가 되도록 분주합니다. 그 후, 세포가 트립신으로부터 회복될 수 있도록 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.그동안 1차 항 glute four 항체와 Alexa Fluor 4 8 8 결합 2차 chicken antigo IgG 항체를 5:1 비율로 혼합하고, 웰당 10 µL의 항체 혼합액이 사용됨을 고려하여 필요한 최종 부피를 계산하십시오. 항체 혼합액을 실온의 암소에서 10분 동안 배양하십시오. 항체 혼합액이 배양되는 동안, 인슐린을 성장 배지로 희석하여 원하는 농도의 2배 농축 작업액(working stock)을 준비하십시오.세포를 1시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 꺼냅니다. 세포가 들어 있는 각 웰에 항체 용액 10 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 최소 한 개의 웰은 염색하지 않은 상태로 남겨두십시오.이 음성 대조군은 이후 유세포 분석기를 설정하는 데 사용됩니다. 다음으로, GLUT4의 세포 표면 전위를 유도하기 위해 각 웰에 2배 농도의 인슐린 스톡 500 µL를 첨가하고, 플레이트를 37 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼낸 후, 각 웰에 1% PFA가 포함된 PBS 1 mL를 첨가하여 세포를 고정하고, 상온의 암소에서 20분 동안 배양합니다. 셀 리프터를 사용하여 고정된 세포를 웰 바닥에서 조심스럽게 떼어내어 각 웰의 세포를 개별 FACS 튜브로 옮깁니다.튜브를 원심분리하여 세포를 펠렛화한 다음, 볼텍싱하고 1 mL의 PBS에 재부유시켜 세포를 세척하고 다시 원심분리하며, 이 세척 과정을 두 번 반복합니다. 세척 단계 사이마다 상층액을 제거합니다.마지막으로 세척된 세포를 400 µL의 PBS 1%PFA에 재부유합니다. 이제 유세포 분석기를 통해 glute four의 표면 발현을 분석할 수 있습니다. 샘플을 가지고 유세포 분석기에 도착하면, 염색되지 않은 대조군부터 데이터 획득을 시작하십시오.전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 사용하여 넓은 생존 세포 게이트(live cell gate)를 설정합니다. 그다음, 히스토그램의 여백 내에 음성 피크(negative peak)가 나타나도록 FL1 채널의 전압 설정을 조정합니다. 이러한 파라미터 설정이 완료되면, 튜브당 최소 10,000개의 생존 이벤트(live events)를 기록하며 각 실험 샘플을 분석합니다.이 히스토그램은 0, 1, 10 또는 100 nM 인슐린에 노출된 근모세포의 표면 GLUT4 염색 상향 조절을 보여줍니다. 이와 대조적으로, 인슐린 저항성이 있는 개인의 근모세포는 100 nM 인슐린에 반응하여 GLUT4를 상향 조절하지 못합니다. 자극된 세포의 평균 형광 강도를 자극되지 않은 세포의 강도로 정규화하면, 건강한 근모세포와 인슐린 저항성 근모세포의 MFI를 직접적으로 비교할 수 있습니다.이 절차를 사용하여, 혼합 집단 내에서 서로 다른 세포 하위 집단을 식별하기 위해 추가적인 표면 또는 세포 내 마커를 염색할 수 있습니다.

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학습하세요 유동세포계측법을 이용한 GLUT4 플라즈마 막 이동 정량화 방법을 배워보세요. 이 기술은 인슐린 반응성 및 대사 질환 연구에 활용될 수 있습니다.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

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