제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

중추신경계를 표적으로 삼아 박테리아와 숙주 면역세포가 포함된 농양을 형성하는 병원성 박테 리아인 마이코박테리아 abscessus에 감염된 제브라피시 배아를 예로 들어보겠습니다.

배아를 얼음 위에 배양해 움직이지 못하게 한 뒤, 심장과 신경 활동을 멈추게 하는 마취제를 과다 투여해 죽음에 이르게 합니다.

잔여 마취제를 제거하기 위해 배아를 세척하세요.

세제 용액을 넣어 세포막을 파괴하고 배아를 용해하세요.

용해물을 바늘로 절단해 조직을 균질화하고 박테리아를 방출합니다.

원심분리기로 상청액을 버린 후, 박테리아 응집을 방지하기 위해 계면활성제 용액에 펠릿을 재현탁합니다.

박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 한천 플레이트에 발라줍니다.

배지에는 항생제가 보충되어 다른 미생물의 성장을 억제하며, 항생제 내성을 위해 설계된 마이코박테리움 세포가 증식합니다.

배아는 집단 형성을 촉진하여 배아의 박테리아 부하를 정량화할 수 있게 합니다.

원하는 시점에 군락 형성 단위(CFU)를 열거하려면, 감염 상태별로 5개의 배아를 채취하여 각 배아를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 배아를 얼음 위에 10분간 부양하여 냉동 마취합니다. 트리카인 리터당 300에서 500밀리그램으로 배아를 안락사시킨 후, 멸균된 물로 새 튜브에서 두 번 세척하세요.

다음으로, 각 배아에 2% Triton X-100 1X PBS에 물을 제거한 후, 26게이지 바늘로 조직을 균질화하여 완전한 용해를 진행합니다.

현탁액을 원심분리한 후에는 1개의 PBST를 사용해 펠릿을 재현탁합니다. 그 후 BBL MGIT PANTA를 보충한 Middlebrook 7H10O^ADC 의 균질체 판 연속 희석을 수행했습니다.

판을 30도 섭씨에서 4일간 배양한 후 군집을 세세요.