Name: 슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 배우세요 생쥐 시상교차상핵(SCN) 슬라이스 준비 및 오가노타입 배양법으로 시계 유전자 발현을 루시페라즈 생체발광으로 실시간 기록하는 방법을 익히세요.

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FONCICYT 000000000091984,, Jeansson의 기초, Söderström Königska sjukhemmet, 마사 Lundqvist 및 시거드 루시 엘사이 작품은 스웨덴 의학 연구 협의회 (K2009 - 75SX - 21028-01 - 3, K2008 - 61X - 20700-01 - 3)에 의해 추진하는 사업 Goljes 민, 그리고 의약 SLS - 95151의 스웨덴어 학회. 교수 진 D. 블록, UCLA는 기꺼이 원고에 대한 귀중한 의견을 인정받고 있습니다. 우리는 비디오 현미경 제공을위한 HCN 채널 차단에 대한 박사 마이클 Andäng 및 박사 헬레나 Johard 감사하고, 교수 압델 엘 - Manira. 윤리적인 고려 사항 : 동물의 모든 실험은 Karolinska Institutet와 &quot;스톡홀름의 Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 모든 가능한 응력이나 동물에 불편을 최소화하기 위해 의도로 수행됩니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

루시페라제 리포터 기술과 장점과 단점 낮의를 공부하기 위해서는 여러 시간 포인트 (샘플링 주파수에 따라 일반적으로 2-4 시간의 낮은 시간 해상도를 제공)에서 조직 샘플을 필요로 원위치 하이브리드화과 서양 얼룩 이러한 RT - PCR로 전직 생체내 방법, 달리 유전자와 단백질 표현의 변화, 루시페라제 리포터 기술은 높은 해상도 (10-10 분) 같은 준비에 많은 일 동안 circadian oscillations의 연구를 수 있습니다. 리듬의 위상 및 기간에 대한 효과 그러므로, 사용하는 동물의 수를 최소화하고 상세한 연구는 일반적으로 낮은 시간 해상도로 기존의 샘플링 기법을 사용 불가능한지, 가능합니다. 리듬의 상대 진폭 측정이 가능 있지만 그러나, 그것은 기자의 기술은 양적하지 않으며 따라서 베꼈는데 유전자 또는 단백질 번역의 양을 측정하는 데 사용할 수 없다는 것을 강조해야합니다. 조직 녹음 organotypic SCN 문화는 성인 뇌의 장기 (주) 약리 조작을 허용하기 시작하고 즉시 culturing, 직접 생체내 빛을 유도 위상 교대 등, 생체내 스트레스의 분자 효과를 공부에 대한 큰 장점 후 분석할 수 손상 성숙한 신경 네트워크와 루시페라제 리포터 기술을 포함하는 조직은 여러 주 동안 안정적인 레코딩이 가능합니다. 따라서 조직은 건강한 문화를 얻기 위해서는 신생아 또는 출생 후의 초기 필요하지 않으며, 급성 만성 슬라이스 약리 치료와는 대조적으로 수행할 수 있습니다. epigenetic 변경은 연구해야하는 경우없이 염색체에 DNA의 결합으로 이어질 할 셀 문화에 플라스미드 - 기자 transfections, 대조적으로, 유전자 변형 루시페라제 - 동물 모델 (뿐만 아니라 lenti 바이러스 transfections)이 유리합니다. 그것은이 상황에서도 발광 이미징은 녹음도 circadian 리듬을 공부 전공 실험실로 활용 단일 SCN의 뉴런 (~ 60-10 μm의)와 다른 세포 유형에 있으므로, 매우 민감한 CCD 카메라 11 요즘 가능하다는 것을 언급해야합니다. 마지막으로, 여러 circadian 조사는 일반적으로 시계 유전자 / 단백질 oscillations 16-19를 공부하기 위해서는 이러한 그린 형광 단백질과 같은 다른 기자를 사용하여 분자 표현의 모니터링을 사용합니다. 슬라이스 두께의 측면 여기에서 권장하는 SCN 슬라이스 (200-300 μm의)의 두께가 감소하거나 원할 경우 증가 수 있습니다. 조직 문화의 몇 일 후에 막에 나가 flattens하지만 그러나, 그것은 조직 7 생존을 보존하기 위해 처음 컷 단면 500 μm의 두께를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 100 μm의보다 얇은 슬라이스가 처리하기 어려운 기계 및 실질적인 이유입니다. SCN (예를 들어 &#39;껍질&#39;, 그리고 지느러미 대 복부 지역 대의 &quot;핵심&quot;) 이내에 다른 지역은 다른 단계와 함께 진동 SCN 조직 이질 때문에 슬라이스의 두께가 루시페라제 출력 신호의 위상에 영향을 미칠 수, 이후 20 differentially이 단계 이후에 다시 동기화 21 교대. 더 많은 조직이 광자의 큰 숫자를 방출 이후 슬라이스의 두께는 광자 개수의 기준에 영향을 미칩니다. 분자 oscillations의 진폭이 방식으로 간접적으로 explant의 크기에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, 제어 및 치료 문화는 항상 같은 크기, 두께가 같은 위상과 같은 진폭과 진동하기 위하여 SCN의 동일한 영역을 포함해야합니다. 두 일방적 핵은 반면에, 서로와 한 유사한 amplitudes와 단계에 진동 vibratome 컷 (차례로 소뇌와 두 반구 사이의 절단 분리는 직각입니다에 의존하는 직각 수평이 아니므로 테이블 표면). SCN의 culturing을 수행하는 조사는 SCN의 문화가 서로 단계에서 진동하지 않는 경험을 할 수도 있습니다. 연습과 깔끔히 기술의 표준화, 조각은 항상 SCN의 동일한 rostro - 꼬리 수준 버렸어요 즉, 결과를 향상됩니다. 중요 단계 <ol><li> 산소 공급이 중요합니다. 두뇌는 산소 22이 많이 필요하기 때문에, 깔끔히 절차 빨리해야합니다 (3.1-3.10 가까이수록 그것은 조직을 건강하게 유지하기 위해서입니다 ~ 5~6분하는 것입니다.) </li><li> SCN은 온도 변화와 매체 교환을 구분합니다. SCN은 온도 민감하고 큰 온도 변화가 단계 맥박 조정기를 이동하고 실험 유물 23가 발생할 수 있습니다. 중간이나 솔루션은 문화에 며칠 후에 약물을 적용하는 예를 들어, 지속적인 실험, 매체 또는 솔루션을 도중에 교환 또는 추가하는 경우n은 사전 예열 36-37로 ° C (챔버와 동일한 온도)뿐만 아니라 전에해야합니다. 중간 교류를 포함 약리 실험에서, 항상 사전에 시설 세포 배양 매체와 함께 작업하는 것이 중요합니다. 또한 / 신선한와 함께 씻어, 무조건 매체는 잠재적으로 분자 SCN 리듬 24뿐만 아니라 다른 세포 유형 문화 25 단계 이동하실 수 있습니다. </li><li> 중간 구성. 정확한 산도와 osmolality 문화 조직을하는 것이 중요합니다. 공기 버퍼링 매체 산도 6.8-8.2의 범위에서 최적의 버퍼 용량을 가지고 있으며, 세포 호흡의 결과로 발생할 수있는 산도의 변화를 버퍼링에 적합합니다 HEPES 많은 양의가 포함되어 있습니다. HEPES는 반면에, 같은 문화 매체 소량에 포함되어있는 나트륨 중탄산염,에 비해 온도 변화에 더 민감합니다. 나트륨 중탄산염는 CO 2 분위기 때문에 적절한 낮은 PH (5.1-7.1) 범위 26에서 큰 버퍼링 용량이 있습니다. 그러나, 공기 버퍼링 매체 (DMEM 2902)에서 나트륨 중탄산염의 금액을 증가 상당히 osmolality를 증가 동시에 매체, 아미노산, 비타민 및 이온의 잘못된 구성에 차례 결과 인치를 diluting없이 추가할 수 없습니다 매체를 준비 조언 : <ol><li> 매체를 혼합하면 정확하고주의하십시오. </li><li> 오직 신선한 또는 갓 해동 주식 솔루션을 사용합니다. </li><li> 매우 높은 osmolality의 경우 그것은 diluting 가치가되지 않습니다. 이상 5~6% - 희석 매체는 대부분 작동하지 않습니다. 너무 낮으면 osmolality를 증가 D - 포도당을 사용합니다. </li></ol></li><li> 단계는 준비 시간으로 인해 교대 슬라이스 준비의 시간은 중요합니다. 슬라이스 절차가 ZT 12월 6일부터 12일까지 사이에 수행되는 경우에는 단계에 제로 또는 최소한의 효과를 얻을 수 있습니다. 모든 슬라이스 해부은 준비 사이의 유사 콘텐츠를 위상으로 인한 오류를 최소화하기 위해 낮의 또는 circadian 사이클의 동일한 단계에서 수행해야합니다. </li></ol> 가능한 수정 <ol><li> 깔끔히 시작하기 전에 산소 (95% O 2, 5 % CO 2)의 포화 버퍼; 급성 SCN의 전기 생리학은 깔끔히는 링어 (ACSF 인공 세리 브로 척수)으로 수행되어야한다. 또한, 산소는 전기 시냅스 활동이 산소 공급 22에 직접 의존으로 전체 깔끔히 절차를 수행하는 동안 버퍼에 지속적으로 추가되어야합니다. </li><li> 수평 및 화살 조각도 성공적으로 준비하고 SCN의 교양 수 있습니다. 저자는 코로나 컷과 비교 경험에 따라 낮은 진폭과 circadian oscillations를 제공 수평 조각에 루시페라제 기록과 경험을했습니다. </li><li> SCN은 약 1mm 길이 rostro - caudally이며 깔끔히 여기에서 설명한 기법은 중앙 지역의 SCN 부분을 취득으로 타겟팅됩니다. 그러나, 하나 이상의 SCN 섹션은 SCN의 핵보다 주동이의 비교 꼬리 수준 circadian 유전자 / 단백질 표현의 조사를 허용, 마우스 및 쥐 두뇌에서 구할 수 있습니다. </li><li> 심지어 어린 동물, 출생 후의 새끼 또는 배아에서 슬라이스 문화가도 준비하실 수 있습니다. 아주 어린 새끼의 두뇌와 두개골이 아주 부드럽고 구분 유의하시기 바랍니다. 또한, 시신경이 얇고 완벽하게 개발되지 않습니다. SCN 영역이 손상되지 않도록 새끼의 머리를 해부 때주의를 가져가라. 그들이 너무 큰 있기 때문에 예를 들어, 마이크로 rongeur 도구는 마우스 새끼의 두개골을 열어 사용할 수 없습니다. 좋은 가위는 어린 새끼에있는 부드러운 조직을 절단 정도입니다. </li><li> 여기에 설명된 커버 유리 기반 문화 기술은 또한 하나의 SCN의 뉴런에서 CCD / EM - CCD 카메라를 사용하여 이미지 발광에도 사용할 수 있습니다. </li><li> 기타 중추 신경계의 지역 및 유전자 변형 PER2에서 말초 장기의 조직 : 루크 동물 쉽게 PER2로, 분자 oscillations 측면에서 얻은 교양 및 분석할 수 : 루크 표현은 다른 조직의 숫자도 많은 일 동안 진동을 계속 및 세포 유형 10. 이러한 주변 조직의 대부분은 인스턴스 간, 생존을위한 멤브레인 필요하지 않지만 대신에 직접적으로 매체 11 목욕 양식입니다. 인해 sectioning로 변화되는 단계는, culturing와 매체 교환이 SCN과 동일한 원칙을 따르지 않을 수 있습니다 주시기 바랍니다. </li></ol> 의미 유전자 변형 마우스 및 쥐 종자 (mPER2 : 륙, mPer1 - 륙 8, 10, 27)에서 루시페라제 효소 활동은 단백질이나 유전자 발현의 리듬을 반영하고 bioluminescence 기록에 의해 평가하실 수 있습니다. 루시페라제 생성된 bioluminescence는 약한 신호를 제공하지만 배경 발광이 방법이 유리하고, 제로에 가까운 것입니다. 또한, 루시페라제 분자가 불안정하고 급속하게 저하되기 때문에 PH가 없습니다장기적인 흥분성의 조명 28 동안 나타날 수 있습니다 ototoxicity. 함께 촬영이 속성은 circadian 연구 루시페라제 리포터 기술이 매우 유리하게 오랫동안 실험 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>B27 보충제 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>커버글라스</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>배양 멤브레인</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM low glucose w/o phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>1L용 분말</td></tr><tr><td>거름종이</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>여과 세트</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>공극 크기 0.22 &amp;#x03BC;m 폴리에테르설폰</td></tr><tr><td>포셉</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>루시페린</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>딱정벌레 루시페린, 칼륨염</td></tr><tr><td>마이크로 론저 툴</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10,000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Size 11</td></tr><tr><td>진공 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>바이브라톰</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

슬라이스 준비, organotypic 조직 culturing과 suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

생리와 행동의 일상 리듬을 조정 중앙 circadian (~ 24 시간) 시계 앞쪽에 시상 하부에있는 suprachiasmatic 핵 (SCN)에 있습니다. 시계는 직접 망막과 시신경을 통해 빛이 의해 동기화됩니다. Circadian oscillations는 시대 (당) 유전자를 포함하는 소위 &quot;시계 유전자&quot;와 그들의 단백질 제품의 여러 부정적인 피드백 루프를 상호 작용에 의해 생성됩니다. 코어 클럭은 멤브레인 탈분극, 칼슘 및 캠프 1에 따라 달라집니다. SCN은 시계 유전자 발현, 신진 대사 활동과 자발적인 전기적 활동에 매일 oscillations을 보여줍니다. 현저하게,이 내생 순환 활동 SCN 2-4 성인 조직 슬라이스에 지속. 이러한 방법으로 생물 학적 시계는 쉽게 맥박 조정기 함수의 분자, electrophysiological 및 신진 대사 조사를 허용, 체외에서 공부하실 수 있습니다. SCN 바로 광학 chiasm 5 위에있는 작은, 잘 정의된 양자 구조입니다. 쥐에서는 각 핵에서 ~ 8.000 뉴런을 포함하여 약 947 μm의 (길이, rostrocaudal 축) × 424 μm의 (폭) × 390 μm의 (높이) 6 규격이 있습니다. 그것은 SCN이 확인할 수 있습니다 두뇌의 특정 수준에서 뇌 슬라이스를 잘라하는 데 필요한 SCN을 해부하다합니다. 여기서는 마우스 및 쥐 머리가 비슷합니다 SCN의 해부와 깔끔히 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 어떻게 막 7, 야마자키 외 의해 SCN 조직 문화의 개발 기술에 organotypically 해부하는 조직 문화를 보여줍니다. 8. 마지막으로, 우리는 유전자 변형 조직은 시계 유전자 / 동적 루시페라제 리포터 기술, 원래 Geusz 외 의해 circadian 측정에 사용된 방법입니다. 9를 사용 단백질의 표현을 측정하는 데 사용할 수 방법을 보여줍니다. 우리는 여기서 유전자 변형에서 SCN의 조직을 사용하는 PERIOD2 인 노크 : 유 외 제작한 루시페라제 쥐 10.. 마우스는 시대의 융합 단백질 (당) 2 반딧불의 효소 루시페라제가 포함되어 있습니다. 루시페라제은 luciferin의 산화를 catalyzes 때 PER2가 루시페라제 즉, luciferin을위한 기판의 존재로 번역하면 PER2 표현식은 bioluminescence으로 모니터링할 수 있습니다. 방출 광자의 개수는 긍정적으로 생산 PER2 단백질의 금액에 상호 및 bioluminescence 리듬은 생체내 10 PER2 단백질 리듬을 일치합니다. 이런 방식으로 PER2 표현의 주기적 변화는 지속적으로 며칠 동안 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 우리가 조직 culturing 실시간 bioluminescence 기록에 대한 수행 프로토콜은 철저하게 야마자키와 다카하시 11 설명했습니다.

성인 마우스 hypothalamic suprachiasmatic 핵 (SCN), 그리고 문화에 빠른 방법 organotypic 문화 상태에있는 SCN의 조직을 포함 준비 슬라이스의 절차가보고됩니다. 또한, 동적 루시페라제 리포터 기술을 사용하여 oscillatory 시계 유전자 단백질 표현의 측정이 설명되어 있습니다.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

생리학 및 행동의 일일 리듬을 조정하는 중심 서카디안(~24시간) 시계는 ...에 위치한 시교차상핵(SCN)에 존재합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 형질전환 마우스에서 시교차상핵을 절편화 및 박리하는 방법과, 발광에 의해 유도된 루시페레이스 형태의 시계 유전자 또는 단백질 발현을 기록하기 위해 해당 조직을 배양하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 시계 유전자 또는 단백질에 대한 루시페레이스 리포터를 포함하는 형질전환 마우스에서 뇌를 적출한 다음, 시교차상핵을 포함하는 뇌 절편을 제작함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 절편에서 작은 양측성 시교차상핵을 박리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 배양액, 배지와 루시페린이 포함된 페트리 접시 내의 막 위에서 도식화된 핵 외편을 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 빛이 차단된 가열 챔버 내에서 광전자 증배관을 이용해 생물 발광을 측정함으로써 루시페라아제 활성을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 시계 유전자 또는 단백질의 일주기 진동을 선택한 결과를 얻을 수 있습니다.제 이름은 Sergey IV이며, Gabrielle Re Club에서 근무하고 있습니다. 제 이름은 SoFi Johansson이며, Gabriella의 팀에서 근무하고 있습니다. 제 이름은 Gabriel Quist입니다.저는 신경과학과의 책임연구원입니다. 제 이름은 Ka LaShon이며, 스웨덴 의료 신경과학 센터(Swedish Medical Neuroscience Center)의 박사 과정 학생으로서 Gabriella와 공동 연구를 진행하고 있습니다. Western Blot, RT-PCR, in situ hybridization과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동일한 조직 내에서 시계 유전자나 단백질의 발현을 약 1분의 매우 높은 해상도로 수일 동안 지속적으로 추적할 수 있어, 일주기 리듬(circadian rhythm)의 주기, 진폭 및 위상을 상세하게 분석할 수 있다는 점입니다. SCN 슬라이싱 및 박리 단계는 습득하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.SEN은 매우 작아서 식별하기 어려울 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 연구팀의 박사후 연구원인 Dr.Sge Velia가 진행하겠습니다. 필요한 용액들을 제조한 후, autoclave 진공 그리스가 충전된 5 mL 주사기를 사용하여 실험에 사용할 페트리 접시를 준비하십시오.35 millimeter 페트리 접시의 상단 링 표면에 그리스를 도포합니다. 슬라이스마다 별도의 페트리 접시를 준비하십시오. 배양을 위해 Falcon 튜브에 10 milliliters의 공기 완충 배지를 채웁니다.이렇게 하면 8개의 배양액에 충분한 양의 배지가 만들어집니다. 갓 해동한 luciferian 10 µL를 첨가하십시오. luciferian은 빛에 민감하므로, Falcon 튜브를 37 °C의 어두운 가열 챔버에 보관하여 luciferian 배지가 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.다음으로, 실험 과정에 사용될 모든 기구, 커버 글라스 및 기타 재료를 멸균합니다. 멸균되지 않은 모든 장비에 70% ethanol을 분무합니다. 기구와 그리스를 칠한 페트리 접시를 멸균 후드 내에서 최소 30분 동안 UV에 노출시킵니다.또 다른 준비 단계는 진동 절단기(vibratome)를 설정하고 멸균 면도날을 부착하는 것입니다. 이제 수술 절차를 위한 장비 설정이 완료되었습니다. 마우스에 마취를 하고 안락사시킨 후, 가위로 머리에서 안구를 제거합니다.이는 시신경의 훈련이나 자극을 방지하여 시교차 상핵(SCN)의 손상을 피하는 데 도움이 됩니다. 미세 가위를 사용하여 마지막 경추와 피부를 제거합니다. 두개골 양측을 따라 뼈에 두 군데 절개선을 넣어 제거 가능한 뚜껑을 만듭니다.마이크로 Rongeur 도구를 사용하여 두개골을 엽니다. Rongeur를 사용할 때는 위쪽 방향으로 움직여야 하며, 도구로 뇌를 절대 아래로 누르지 마십시오. 시교차전핵(SCN)의 손상을 방지하기 위해 후각구(olfactory bulbs)가 보일 때까지 모든 뼈를 제거합니다.미세 해부용 스프링 가위를 사용하여 양쪽 뇌 반구와 후각구 사이의 시신경을 조심스럽게 절단합니다. 마우스 머리 아래에 50~100 mL의 차가운 HBSS가 채워진 페트리 접시를 놓습니다. 머리를 뒤집어 손상되지 않은 뇌가 자연스럽게 빠져나오게 합니다.시신경의 반대편에서 필요한 다른 뇌신경들을 절단합니다. 뇌가 분리되면 페트리 접시로 떨어지며, 이를 통해 뇌가 빠르게 냉각됩니다. 숟가락을 사용하여 얼음처럼 차가워진 뇌를 뒤집어 놓은 유리 페트리 접시 뚜껑과 같은 멸균된 절단 표면으로 옮깁니다.멸균된 면도날을 사용하여 대뇌 반구와 소뇌 사이를 수직으로 절개하여 소뇌를 제거합니다. 바이옴(viome)의 건조한 플랫폼에 순간접착제를 도포합니다. 날카로운 곡선 핀셋을 뇌의 전측(rostral part)에 삽입하고, 핀셋으로 뇌를 잡아 들어 올립니다.멸균 필터 페이퍼를 사용하여 HBSS를 조심스럽게 닦아냅니다. 吻측(rostral) 끝이 위를 향하고 복측(ventral) 표면이 절단 칼날에 가장 가깝게 하여 뇌 반구를 플랫폼의 접착제 위에 고정합니다. 플랫폼을 진동 절편기(vibratome) 홀더에 장착하고 즉시 차가운 HBSS를 채웁니다.수직 절단이 제대로 이루어졌다면, 반구들이 똑바로 서 있어야 합니다. 목표는 진동 절단기의 최대 속도를 사용하여 양측 SCN의 중앙 부위를 포함하는 관상면 절편을 만드는 것입니다. 교차점에 도달할 때까지 반구의 500 to 800 µm 두께 절편을 계속해서 절단하십시오.시청하십시오.시각교차가 넓어짐에 따라 절편 두께를 100 µm로 줄여 코들(coddle) 방향으로 계속 슬라이싱하며, 두 개의 SCN 핵이 나타나기 시작할 때까지 블레이드의 수평 수동 이동 속도를 늦춥니다. SCN 높이에 도달했을 때 핵을 시각화하기 위해 필요한 경우 확대경을 사용하십시오. 250 µm 두께의 SCN 절편을 절단합니다.부드러운 브러시를 사용하여 중간 크기의 페트리 접시 뚜껑에 차가운 HBSS를 채웁니다. SCN 뇌 절편을 들어 올려 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.다음 단계는 절편에서 SCN을 분리하는 것입니다. 현미경을 사용하여 절편의 적어도 한쪽 면에서 양측 SCN이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 멸균된 메스 한 쌍을 사용하여 양쪽 SCN이 모두 포함된 한 변의 길이가 약 1.5 millimeters인 정사각형 모양의 조직을 절제하십시오.SCN에 최대한 가깝게 절단하십시오. SCN 조직을 제거하지 않은 상태에서 시신경의 작은 조각이 설명편(explan)에 부착되어 있어야 하며, 다른 핵이 포함되어서는 안 됩니다. 양측 SCN이 포함된 조직을 절반으로 잘라 두 개의 단측 SCN을 얻습니다.멸균 후드 내에서 하나의 편측 SCN을 대조군으로 사용할 수 있습니다. 조명을 끈 상태에서 35 millimeter 직경의 Petri dish에 Lucifer 배지 1200 microliters를 넣고, 액체 표면 위에 배양 막을 올립니다. 막 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.임플란트의 크기가 매우 작아 집어 올리기 어렵습니다. 따라서 팁이 장착된 1000 µL 피펫을 사용하여 SEN 이식물을 팁 안으로 빨아들인 후 배양 막 위에 밀어내어 놓으십시오. 루시퍼레이즈 기록을 위해 과잉의 HBSS를 제거하고 페트리 접시당 하나의 SEN만 배치하십시오.그리스가 도포된 페트리 접시를 직경 40 millimeter 커버 글라스로 밀봉합니다. 밀봉이 견고하지 않은 경우 그리스를 더 추가하십시오. 페트리 접시를 36 to 37 degrees Celsius의 차광 가열 챔버 내에 배치된 알루마 사이클 장치로 옮깁니다.배양을 시작하려면, lum 사이클 챔버 내부에 장착된 배양 접시와 광전증배관 검출기 어셈블리를 확인하십시오. 배양 접시를 광전증배관 아래 약 1~2cm 지점에 배치하십시오. 광전증배관은 생물 발광에 의해 유도된 루시퍼레이스를 검출하고 증폭합니다.데이터 수집에는 Luma Cycle 소프트웨어 도구가 사용됩니다. 유전자 단백질 발현의 고해상도 데이터를 얻기 위해 1분에서 10분 간격으로 광자 수를 적분합니다. 유전자 단백질의 일주기 발현을 분석하여 리듬의 위상, 주기 및 진폭을 결정합니다.이 그림은 건강한 SCN 조직 배양물과 건강하지 않은 SCN 조직 배양물에서 측정한 생물 발광 기록을 보여줍니다. 이 마우스들은 SCN 조직을 제거하기 전 12시간 명기 및 12시간 암기 조건에서 사육되었습니다. 검은색 선은 period 2 루시페레이스 발현의 생물 발광 기록에 나타난 일주기 리듬을 나타냅니다.건강한 SEN 슬라이스에서 단백질은 일주기 변동에 따라 진동하며, 단백질의 최대 발현은 ze gaber time 12~13 또는 암기 시작 시점에 발생합니다. 따라서 유전자 리듬의 위상은 동물 희생 전의 명암 주기에 따라 달라집니다. 파란색 선은 화살표로 표시된 4일째에 배양 접시를 연 후 제대로 밀봉하지 않아 건조된 SE 배양물의 생물 발광 기록을 나타냅니다.빨간색 선은 건강하지 않은 SCN 배양물에서 측정한 생물 발광 기록을 나타냅니다. 이 그림은 약리학적 실험에 사용된 SCN 배양물을 보여줍니다. 그림은 첫 번째 화살표로 표시된 시점에 HCN 이온 채널 차단제를 처리한 배양물의 추적선을 보여줍니다.2~3일에 걸쳐, 이온 채널 차단제는 두 번째 화살표 지점에서 일주기 진동을 감소시킨 후 중단시켰습니다. 이 절차를 수행하는 동안 약물을 세척하고 조건화된 대조군 배지로 교체했습니다. SEN 조직의 생존력을 유지하기 위해 빠르고 신중하게 작업하는 것이 중요합니다.또한 매번 동일한 수준의 SEN을 얻을 수 있도록 진동 절편 제작(vibram sectioning)을 표준화하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 SEN 배양물과 SCN 기관을(보통 막 위에서) 절단 및 해부하는 방법과, 배양물 내에서 루시페레이스(luciferase)에 의해 유도되는 발광을 통해 시계 유전자 또는 단백질 발현을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

출처: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. 초파리  애벌레 뇌의 일주기 시계의 단일 세포 해상도 형광 라이브 이미징 문화. J. Vis. 특급 (2018).   이 동영상은  초파리 뇌를 섬유소 매트릭스에 삽입한 다음 일주기 시계 뉴런의 저속 형광 이미징을 통해 명/암 주기와 동기화된 리듬 활동을 분석하는 절차를 보여줍니다.

일주기 시계 뉴런의 타임랩스 이미징을 위한 매트릭스에 초파리 뇌 내장(Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons)

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.

Vivo에서 형광 기자를 사용 하 여 마우스 Suprachiasmatic 핵에서 Circadian 시계 유전자 발현의 모니터링

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

이 보고서는 시계열 실험에서 얻은 대규모 데이터 세트를 분석하기 위해 오픈 소스 소프트웨어 RStudio의 R 스크립트를 사용하는 방법을 설명합니다.

대규모 데이터 세트에 대한 사용자 친화적이고 강력한 R 분석

배우세요 생쥐 시상교차상핵(SCN) 슬라이스 준비 및 오가노타입 배양법으로 시계 유전자 발현을 루시페라즈 생체발광으로 실시간 기록하는 방법을 익히세요.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

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