달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

이 절차의 전반적인 목표는 내부 유모 세포 구심성 시냅스에서 시냅스 후 활동을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 목이 잘린 쥐에서 최근에 제거된 달팽이관의 감각 상피를 노출시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 절제된 정점을 배치하고 수정된 커버 슬립을 켠 다음 기록 챔버로 옮기는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 기록 전극이 있는 구심성 지휘봉을 찾아 접근하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 구심성 섬유막에 단단히 밀봉된 다음 파열하여 패치 클램프 기술의 전체 세포 구성을 확립하는 것입니다. 궁극적으로, 단일 리본 시냅스에서 전체 세포 패치 클램프 전기생리학을 통해 시냅스 후 발생 또는 전위를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 달팽이관 조직의 해부 및 준비는 배우기 어렵고 작은 구심성 섬유를 인식하고 접근하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 해부를 시작하기 전에 녹음하는 동안 준비를 제자리에 고정할 수정된 커버 슬립을 준비하십시오. 8-12mm 원형 유리 커버 슬립을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 향해 반쯤 경화된 실 가드 한 방울을 바릅니다.

커버 슬립에 미세한 곤충 핀의 두꺼운 끝을 놓습니다. 곤충 핀을 유리에 단단히 잡습니다. 집게를 사용하여 가열된 코일에 대해 실 가드를 가열하여 설정합니다.

10-20개의 마이크로 전극을 함께 제공되는 텍스트에 설명된 대로 준비합니다. 마이크로 단조로 화재 연마 후 마이크로 전극은 약 1미크론의 외부 팁 직경을 가져야 합니다. 피펫 벽의 최종 두께는 3주 된 쥐의 마취 및 참수 후 마이크로미터의 약 1/3과 같습니다.

피부를 제거하고 머리를 절개하고 뇌를 제거하여 박리를 시작합니다 측두골을 노출시키려면 두 측두골을 모두 제거합니다. 각 측두골을 표준 세포외 용액이 들어 있는 깨끗한 해부 접시에 넣습니다. 다음 단계는 달팽이관을 노출시키기 위해 측두골을 캡슐화하여 뼈를 제거하는 것입니다.

한 쌍의 집게로 측두골의 바닥을 단단히 잡습니다. 동그랗고 타원형인 창과 달팽이관을 확인합니다. 달팽이관의 타원형 창과 나선형 면이 위쪽을 향하도록 달팽이관의 방향을 잡습니다.

달팽이관 주변의 여분의 뼈를 제거합니다. 두 번째 가는 집게를 사용하여 달팽이관의 나머지 부분보다 더 투명한 부분부터 시작하여 달팽이관에서 직접 뼈를 깎아냅니다. 여기서 뼈는 더 얇고 제거하기가 더 쉽습니다.

정점 코일 주변의 뼈를 계속 제거합니다. 마이크로 해부 가위를 사용하여 정점 회전 아래의 모디를 자릅니다. 그런 다음 달팽이관의 아래쪽 회전에서 정점 회전을 분리합니다.

정점 코일을 보호하도록 주의하십시오. 당기거나 잡아당기면 안 됩니다. 마지막으로, 조직을 너무 많이 찢지 않고 달팽이관에서 정점 회전을 제거합니다.

가는 집게를 사용하여 뼈의 나머지 부분을 제거합니다. 다음 단계는 안구의 STR과 경막을 제거하는 것입니다. 유모 세포 영역 외부에 위치한 반짝이는 조직 스트립인 안구의 STR을 조심스럽게 제거합니다.

안구의 STR과 함께 쉽게 분리될 수 있는 감각 유모 세포를 제거하지 않도록 하십시오. 그런 다음 가는 집게를 사용하여 경골 막을 분리합니다. 감각 유모 세포 위에 있는 반짝이는 반투명 막은 이제 과도한 조직과 뼈를 다듬고 겸자로 준비물을 평평하게 만듭니다.

이것은 조직이 핀 아래에 고르게 배치될 수 있도록 하기 위해 필요합니다. 이제 해부가 완료되었습니다. 준비된 커버 슬립의 핀 아래에 제제를 놓고 해부가 완료되면 핀을 유모 세포에서 멀리 배치하도록 주의하십시오.

겸자를 사용하여 제제를 기록 챔버로 옮기고 달팽이관 조직을 고정하는 커버 슬립에 세포 외액을 한 방울 떨어뜨리면 즉시 세포 외 용액이 풍부해지기 시작합니다. 제제의 생존율을 높이려면 현미경의 10 x 대물렌즈 또는 40 x Water Immersion DIC 대물렌즈를 사용하십시오. 제제를 찾으려면 기록 전극이 내부 유모 세포에 측벽에 직각으로 접근할 수 있도록 제제의 방향을 지정합니다.

제제가 말려 있어 내부 유모 세포의 기저 영역의 가시성이 제한된 경우 기록 전극을 사용하여 제제의 바깥쪽 가장자리를 유리 커버 슬립에 대고 아래로 누릅니다. 내부 유모 세포 자체를 누르지 않도록 주의합니다. 이 제제에서 상부 전극은 제제의 바깥쪽 가장자리를 구심성 배턴이 있는 하부 전극 마크 아래로 고정합니다.

참고로, NC 70 Nuv Con 카메라는 내부 유모 세포 영역의 조직이 건강한지 여부를 평가하기 위해 모니터에 확대 이미지를 표시합니다. 기준점으로 모발 다발을 찾고 핵을 찾기 위해 초점을 맞춥니다. 구심성 끝이 있는 내부 유모 세포의 기저부를 향해 더 아래로 초점을 맞추고 모니터의 핵 수준에 도달할 때까지 다시 위로 올라갑니다.

이제 내부 유모 세포의 기저부 주위에 구심성 배턴을 찾습니다. 배턴은 구형 또는 타원형이며 직경이 약 1 미크론이며 광택이 나는 밝은 색입니다. 위아래로 초점을 맞추면 찾을 수 있습니다.

다음 단계는 세포 내 용액으로 채워진 1미크론 팁이 있는 기록 전극을 사용하여 구심성 섬유로 가는 경로를 청소하는 것입니다. 양압을 가하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 준비물로 이동합니다. 이 전극을 사용하여 내부 유모 세포 기저부 수준에서 제제를 절개합니다.

양압을 사용하여 지지 세포의 얇은 층과 내부 유모 세포 사이의 전극을 밀어 내부 유모 세포의 기저부에 대한 접근 경로를 만듭니다. 전극을 조심스럽게 제거하고 세포 내 용액으로 채워진 직경 1미크론 팁이 있는 새 전극으로 교체합니다. 깨끗한 전극 팁을 유지하기 위해 양압을 사용하여 인접한 지지 셀 주위의 액세스 구멍을 통해 기록 전극을 구심성 배턴으로 이동합니다.

전극 팁이 구심성 배턴 배턴 바로 앞에 있는지 확인하고, 지지 세포와 내부 유모 세포막보다 피펫의 움직임에 더 많은 저항을 제공합니다. 이 차이는 피펫이 움직이고, 피펫을 위아래로 움직이고, 부통이 움직이는지 확인하기 위해 밀 때 느낄 수 있습니다. 이것은 피펫 팁과 부톤이 전극이 구심성 부톤에 눌린 상태에서 동일한 초점면에 있음을 나타냅니다 : 동시에 양압을 해제하고 흡입을 적용하여 기가 옴 씰을 형성합니다.

전극 내부의 멤브레인을 파열하여 전체 세포 기록을 얻기 위해 부드럽게 흡입합니다. 패치된 셀이 구심성 배턴인 경우, 전체 셀 기록 모드에서 작은 용량성 과도 현상이 관찰됩니다. 이 그림은 구심성 파이버에서 기록된 일반적인 과도 현상을 보여줍니다.

시냅스 활동을 기록하기 시작합니다. 구심성 섬유가 자발적인 활동을 보이지 않으면 칼륨 농도가 더 높은 세포 외 용액을 적용하여 유모 세포를 탈분극시킵니다. 이 그림은 왼쪽의 AFF 파이버와 오른쪽의 내부 유모 셀에 대한 일반적인 전류 전압 관계를 보여줍니다.

전류 전압 관계는 마이너스 84 밀리 볼트의 유지 전위로 기록되었으며, 전압 단계는 마이너스 124 밀리 볼트에서 10 밀리 볼트 단위로 양의 36 밀리 볼트까지 기록되었습니다. 전압은 구심성 섬유의 전류 전압 관계에 초점을 맞춘 일부 트레이스의 오른쪽에 표시됩니다. 흥분성 시냅스 후 발생 또는 EPC는 대부분의 전압 단계 동안 존재합니다.

EPC는 약 양의 6밀리볼트에서 포지티브를 반전시켰습니다. 이 기록은 차단제 없이 전압 의존성 나트륨 전류를 차단하기 위해 테트라 대 독소가 있는 상태에서 수행되었으며, 빠른 활성화 나트륨 내부 전류가 기록에 추가로 나타나고 기록이 구심성 광섬유 기록으로 식별되었을 것입니다. 과분극 전압에서 천천히 활성화되는 내부 전류에 유의하십시오.

이 전류는 내부 유모 세포 또는 지지 세포에 존재하지 않으며 기록이 구심성 섬유에서 발생한다는 좋은 표시를 제공합니다. 이 기록은 내부 유모 세포에 대한 전류 전압 관계를 보여줍니다. 화살표는 양의 전위에서 빠르게 활성화되는 바깥쪽 칼륨 전류를 가리킵니다.

그 다음에는 지연된 정류기 칼륨 전류가 발생하는데, 이는 좁은 피펫 직경과 높은 접근 저항으로 인한 것입니다. 여기에 표시된 내부 유모 세포 전류는 내부 유모 세포 전류의 정확한 기록을 얻기 위해 예상보다 작습니다. 접근 저항이 낮은 피펫을 사용해야 합니다.

그러나 여기에 제시된 기록은 내부 유모 세포와 구심성 섬유의 전류 전압 관계를 명확하게 구별할 수 있음을 보여줍니다. 이 그림은 구심성 섬유에서 기록된 시냅스 전류를 보여줍니다. EPC의 다양한 크기와 모양에 유의하십시오.

녹음은 전압 의존성 나트륨 전류를 차단하기 위해 테트라 토인이 적용된 실온에서 수행되었습니다. 이 그림은 내부 유모 세포와 접촉하는 구심성 배턴의 동시 기록을 보여줍니다. 전압 단계를 사용하여 내부 유모 세포를 탈분극시켰고, 이에 대한 응답으로 내부 유모 세포에서 칼슘 유입을 기록하여 신경 전달 물질 방출을 초래하고 구심성 배턴에서 EPC를 활성화했습니다.

이 절차를 시도하는 동안 50밀리초 동안 나타나는 시냅스 함몰은 내부 유모 세포 탈분극 중에 나타납니다. 달팽이관 조직을 해부하고 준비할 때 주의를 기울이고, 구심성 말단에서 기록을 시도할 때 인내심을 갖고 낙관적인 태도를 유지하는 것이 중요합니다.