감자 식물에서 Potato Virus X 기반의 마이크로RNA 사일런싱

in vitro에서 배양한 감자 식물을 준비합니다.

다음으로, 전달 DNA(T-DNA)를 포함하는 식물 병원균인 재조합 Agrobacterium을 사용합니다.

T-DNA는 특정 식물 마이크로RNA를 격리하기 위해 비코딩 RNA를 인코딩하도록 설계된 전체 길이의 감자 바이러스 X 게놈을 운반합니다.

박테리아를 잎에 침투시키고, 박테리아가 도포된 이쑤시개로 줄기를 긁어줍니다.

접종 부위에서 박테리아는 T-DNA를 절단하여 단일 가닥 DNA 형태로 식물 세포 내로 전달합니다.

숙주 세포의 기전을 이용하여, T-DNA는 바이러스 게놈 RNA를 생성하며, 이는 복제되어 비코딩 RNA와 바이러스 단백질을 발현합니다.

비코딩 RNA가 표적 식물 microRNA에 결합하여, 이들이 표적 mRNA에 결합하는 것을 방지함으로써 발달 결함을 유도합니다.

그동안 바이러스 게놈 RNA는 리보핵단백질 복합체를 형성하여 원형질연락사를 통해 전신적으로 확산되며, 이를 통해 식물 전체에서 마이크로RNA 사이런싱을 가능하게 합니다.

이소성 돌출부(ectopic outgrowths) 및 나팔 모양의 잎을 포함한 잎의 이상 증상은 억제된 microRNA의 발달적 역할을 나타냅니다.

600 nm에서의 광학 밀도가 1.0에 도달하면, 원심분리를 통해 Agrobacterium 액체 배양액을 수집하고, 펠릿을 충분한 부피의 침투 버퍼(infiltration buffer)에 재현탁하여 600 nm에서의 광학 밀도를 1.0으로 조정합니다.

실온에서 6시간 동안 배양한 후, 1 mL 바늘 없는 주사기에 Agrobacterium 현탁액을 채우고 한 손으로 감자 식물의 전개된 잎을 뒤집어 잡습니다.

한 손의 손가락으로 원하는 침투 부위의 잎 앞면(adaxial side)에서 엽신(leaf lamina)을 받치고, 다른 손으로는 주사기를 잎 표면에 수직으로 세워 100~200 µL의 Agrobacterium 배양액을 엽신 뒷면(abaxial side)으로 침투시킵니다.

다음으로, 이쑤시개를 사용하여 Agrobacterium 배양 플레이트에서 콜로니를 채취하고, 침윤시킨 감자 식물의 첫 번째 또는 두 번째 마디 줄기 표면과 줄기 표피를 긁어줍니다. 그 후 침윤시킨 식물을 온실에서 2~4주 동안 재배합니다.