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미생물학
0 조회수 • 2:54 분 • August 31st, 2026
녹색 형광 단백질 유전자를 운반하는 아데노 부속 바이러스가 미리 주입된 망막 장벽 파괴 마우스 모델로부터 적출한 안구를 준비합니다.
파괴된 망막 장벽을 통해 AAV가 광수용기 세포로 침투할 수 있으며, 이곳에서 바이러스 게놈이 발현되어 GFP를 생성함으로써 세포가 형광을 띠게 됩니다.
각막과 수정체를 제거하도록 안구를 해부하여 안구 컵(eyecup) 상태를 유지합니다.
망막 구조를 보존하기 위해 안구를 고정액에 담급니다.
안구 컵을 농도가 점차 증가하는 동결 보호제 용액에 순차적으로 옮깁니다. 이후, 얼음 결정 형성을 방지하기 위해 최종 농도의 용액에서 배양합니다.
안구 컵을 동결 매질에 매립하고 동결시킵니다.
크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 안구컵을 얇은 절편으로 자릅니다.
절편을 슬라이드 위에 부착합니다. 이후 면역염색 과정에서 항체가 조직에 접근할 수 있도록, 계면활성제가 포함된 완충액을 첨가하여 조직을 투과성 있게 만듭니다.
절편을 헹굽니다. 면역염색 중 비특이적 항체 상호작용을 방지하기 위해 블로킹 용액으로 처리합니다.
망막 동결절편이 준비되었으며, 이후 면역염색 과정과 형광 이미징을 진행할 수 있습니다. GFP 양성 형광 세포는 바이러스 형질도입이 성공적으로 이루어졌음을 나타내며, 이는 망막의 투과성을 보여줍니다.
안락사시킨 주입 동물로부터 안구를 적출한 후, 안구를 절개하여 수정체와 각막을 제거합니다. 그런 다음 절개한 안구를 4% paraformaldehyde에 1시간 동안 침전 고정합니다. 1시간 후, 실온에서 10% sucrose로 안구를 1시간 동안 동결 보호합니다. 이어서 실온에서 20% sucrose에 안구를 20분 동안 담급니다.
마지막으로, 눈 조직을 30% sucrose 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, Cryo-matrix와 같은 매립 수지에 안구 컵을 매립하여 동결시킵니다. 그 후 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 10 µm 두께의 절편을 만들고, 동결 조직용으로 준비된 슬라이드에 부착합니다.
이제 슬라이드 위의 절편을 계면활성제로 5분 동안 투과화합니다. 이어서 PBS로 짧게 두 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 안구 조직을 블로킹합니다.