0 조회수 • 2:24 분 • August 31st, 2026
형광 단백질을 인코딩하는 목적 유전자를 포함하는 아데노 부속 바이러스(AAV)를 이전에 주입한 형질전환 마우스의 눈으로 시작합니다.
이 마우스는 망막을 유리체강으로부터 분리하는 장벽인 내경계막(inner limiting membrane, ILM)의 무결성을 유지하는 데 필수적인 유전자가 결핍되어 있습니다.
이 유전자의 결손은 망막 변성을 모방하며, 이를 통해 바이러스가 망막 세포층 더 깊숙이 침투할 수 있게 합니다.
감염된 망막 세포는 목적 유전자를 발현하여 형광 단백질을 생성하며, 이를 통해 형광을 띠게 됩니다.
이제 안구를 해부하여 각막과 수정체를 제거합니다.
망막을 망막 색소 상피(RPE) 및 눈의 외층인 공막으로부터 조심스럽게 분리합니다.
조직을 고정액에 담급니다.
잔류 고정제를 제거하기 위해 인산 완충액으로 세척합니다.
공초점 현미경으로 관찰했을 때, 망막 세포의 형광은 손상된 내경계막을 통해 바이러스가 성공적으로 침투했음을 나타냅니다.
망막 평면 표본(flat mount) 제작을 위해, 적출된 안구를 4% paraformaldehyde에 15~30분 동안 고정하여 박리를 용이하게 합니다. 이 고정 과정과 박리 후의 고정 단계는 GFP 형광을 보존하는 데 결정적이므로 적절하게 수행되어야 합니다. 고정 후 15~30분 이내에 안구를 박리하여 각막과 수정체를 제거합니다.
톱니모양선(ora serrata)과 시신경 주변을 절개하여 망막을 망막색소상피와 공막으로부터 분리합니다. 박리 후, 조직과 형질전환된 망막 세포 내의 형광 단백질을 고정하기 위해 망막을 4% paraformaldehyde에 30분 동안 더 침전시킵니다. 고정이 끝나면, pH 7.4의 멸균 PBS로 시료를 5분 동안 세척합니다.