재조합 B형 간염 바이러스 입자의 생산 및 정제

콜라겐 코팅 디쉬에서 배양된 간세포로 시작합니다.

변형된 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus 또는 HBV) 게놈을 운반하는 플라스미드 하나와 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 또 다른 플라스미드가 복합체로 결합된 트랜스펙션 시약을 도입합니다.

플라스미드가 세포 내로 진입할 수 있도록 배양합니다. 세포 내에서 바이러스 유전자가 발현되어 구조 단백질과 변형된 HBV 게놈이 생성되며, 이들이 조립되어 재조합 HBV 입자를 형성합니다.

배지를 교체하고 배양하여 바이러스 입자의 생성 및 방출을 유도합니다.

배지를 수확하고 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화합니다.

상층액을 수집하고 필터링하여 남은 잔해물을 제거합니다.

다음으로, 바이러스 입자를 침전시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 염화나트륨을 첨가합니다.

원심분리하여 내용물을 펠렛화합니다. 펠렛을 버퍼에 녹이고 원심분리하여 찌꺼기를 제거합니다. 그런 다음, 이를 수크로스 쿠션 위에 층이 쌓습니다.

초원심분리를 수행하여 쿠션을 통해 바이러스 입자를 침전시킵니다.

상청액을 제거하고 펠릿을 배지에 재현탁합니다.

현탁액을 필터링하고 정제된 재조합 HBV를 저온에 보관하여 후속 분석에 사용하십시오.

세포 배양 배지를 준비한 후, transfection 전날 10cm 콜라겐 코팅 디쉬에 $4 \times 10^6$개의 HepG2 세포를 배지와 함께 분주한다. 해당 세포를 37°C의 습윤한 5% $\text{CO}_2$ 배양기에서 배양한다.₂ 인큐베이터. 제조사의 지침에 따라 트랜스펙션 시약을 사용하여, 5 mcg의 pUC1.2HBV를 세포에 트랜스펙션한다.Δε, 그리고 5 µg의 pUC1.2HBV/NL.

다음 날, 배양액을 제거하고 10 mL의 신선한 배양액을 추가합니다. 그 후, 형질전환 1주일 뒤에 재조합 HBV가 포함된 배양액을 50 mL 튜브로 옮깁니다.

그런 다음, 배양액을 수집하여 2,30 x g에서 5분 동안 원심분리하여 재조합 HBV가 포함된 세포 잔해를 제거합니다. 상층액을 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과합니다. 그런 다음 여과액에 동일한 부피의 25% PEG, 1.5 M NaCl을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.

시료를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 용액을 2,300 x g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 0.5 mL의 TNE 완충액에 녹입니다. 그런 다음 recombinant HBV가 포함된 TNE 0.5 mL를 T