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미생물학
0 조회수 • 2:30 분 • August 31st, 2026
렌티바이러스 형질전환을 용이하게 하기 위해 일부 해리된 마우스 장 오가노이드를 사용하여 시작합니다.
트랜스덕션 배지에 렌티바이러스 벡터를 준비합니다.
렌티바이러스는 숙주 게놈에 안정적으로 통합될 목적 유전자를 운반합니다.
렌티바이러스를 웰에 첨가합니다.
바이러스가 진입할 수 있도록 혼합물을 배양합니다.
바이러스 RNA가 DNA로 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.
오가노이드 배지를 추가하고 혼합물을 튜브로 옮깁니다.
결합되지 않은 바이러스를 제거하기 위해 원심분리합니다.
펠릿을 기저막 매트릭스(basement membrane matrix)에 혼합합니다.
오가노이드를 웰에 넣고 고체화될 때까지 둡니다.
매트릭스는 오가노이드를 가두고 구조적 지지력을 제공하는 네트워크를 형성합니다.
오가노이드 증식을 돕기 위해 성장 촉진제가 첨가된 오가노이드 배지를 추가합니다.
그 결과로 형질전환된 유전자를 포함하는 출아 오가노이드(budding organoids)가 생성되며, 이는 추가적인 기능 분석에 사용될 수 있습니다.
이 마지막 소량의 배지에 들어있는 오가노이드를 48-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
이전에 준비한 고역가 렌티바이러스를 트랜스덕션 배지에 넣어 오가노이드에 추가하고 재현탁합니다. 트랜스덕션이 일어날 수 있도록 오가노이드-바이러스 혼합물을 배양 인큐베이터에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 오가노이드-바이러스 혼합물에 오가노이드 배양 배지 1 mL를 추가하여 재현탁한 뒤, 혼합물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 850 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
오가노이드를 펠렛화하기 위해 상층액을 제거하고 펠렛을 20 µL의 차가운 Matrigel에 재현탁합니다. 이 액적을 웰 중앙에 놓습니다. 48-웰 플레이트에서 37 °C로 15분 동안 배양하여 액적을 응고시킵니다. 15분 후, nicotinamide와 키나아제 억제제가 첨가된 오가노이드 배양액 250 µL를 조심스럽게 첨가합니다.