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유방암 세포 배양물을 준비합니다.
두 종류의 아데노바이러스를 공동 감염시킵니다. 그중 하나는 상시 활성 프로모터 하에 녹색 형광 단백질 또는 GFP 유전자를 운반합니다.
다른 하나는 SMAD 반응성 프로모터 하에 적색 형광 단백질 또는 RFP를 인코딩하는 리포터 유전자를 포함합니다.
시험 배양액에 TGF-beta를 첨가하고 배양합니다.
바이러스가 수용체에 결합하여 숙주 세포로 진입하고, 핵 내로 유전자를 전달하여 GFP 발현을 가능하게 합니다.
시험 세포에서 TGF-beta는 수용체와 결합하여 SMAD2 및 SMAD3 단백질을 인산화함으로써 SMAD 경로를 활성화합니다.
이 단백질들은 SMAD4와 복합체를 형성합니다.
이 복합체는 리포터 유전자의 프로모터에 결합하여 GFP 외에 RFP 발현을 가능하게 합니다.
대조군에서는 SMAD 경로가 비활성 상태로 유지되어, 세포가 GFP만을 발현하게 됩니다.
살아있는 세포의 형광 이미지를 캡처합니다.
두 신호가 모두 나타나는 것은 이중 아데노바이러스 형질도입을 통한 SMAD 경로 활성화를 확인시켜 줍니다.
아데노바이러스 감염 당일에, 12-well plate의 각 well에 약 1.25 x 10⁵개의 MDA-MB-231 세포를 500 µL의 배지에 분주하여 35%의 세포 합류도(confluency)가 되도록 합니다. 모든 well의 세포에 75 µL의 adenovirus-CMV-GFP와 7.5 µL의 adenovirus CAGA12-Td-Tomato를 감염시켜 100%의 감염 양성률을 달성할 수 있는 2,500 MOI를 확보합니다. 그 후, 아데노바이러스 감염 직후 처리군 well에 TGF-beta를 첨가합니다.
37 °C, 10% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 위상차 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포를 촬영합니다.