감염된 인간 림프구 내 바이러스 핵산 및 단백질의 다중 형광 이미징

슬라이드에 부착된 커버슬립 위에서 HIV-1에 감염된 인간 림프구로 시작합니다.

이 세포들은 바이러스 RNA와 프로바이러스 DNA를 형광으로 표지하는 프로브와 혼성화되었습니다.

항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 세포를 블로킹 용액에 넣고 배양합니다.

HIV-1 캡시드 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 처리합니다.

1차 항체가 캡시드 단백질에 결합할 수 있도록 배양합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 버퍼로 세포를 세척합니다.

1차 항체에 결합하는 형광 표지 2차 항체를 첨가합니다.

결합되지 않은 항체를 씻어냅니다.

세포의 핵을 염색하기 위해 DNA 특이적 염료를 첨가한 후, 세척하여 과량의 염료를 제거합니다.

다중 형광 이미징을 사용하여 바이러스 DNA, RNA, 단백질 및 호스트 핵을 서로 다른 색상으로 동시에 검출하십시오.

이 단일 세포 시각화 기술을 통해 감염된 세포 내의 바이러스 DNA, RNA 및 단백질을 동시에 시각화함으로써 바이러스 생명 주기(viral life cycle)의 다양한 단계를 연구할 수 있습니다.

관심 단백질의 면역염색을 위해, 마지막 세척 후 각 커버슬립에 200 microliters의 blocking buffer를 처리하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 종료 후, 블로킹 버퍼를 따라내고 1% bovine serum albumin이 첨가된 PBS plus Tween 20에 희석한 목적 1차 항체 200 microliters를 추가합니다. 상온에서 1시간 동안 배양한 후, 각 세척 단계마다 흔들어주며 신선한 PBS plus Tween 20로 10분씩 두 번 슬라이드를 세척합니다. 그 다음, 적절한 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 동안 시료를 라벨링합니다. 배양 종료 후, 각 세척 단계마다 흔들어주며 신선한 PBS plus Tween 20로 10분씩 슬라이드를 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 상온에서 1분 동안 적절한 핵 염색약으로 핵을 대조 염색하고, 이어서 상온에서 흔들어주며 PBS로 10분 동안 두 번 세척합니다.