JoVE 실험 백과사전
미생물학
0 조회수 • 3:36 분 • August 31st, 2026
프로토타입 포미 바이러스(prototype foamy virus) 또는 PFV 인타좀(intasome)의 침전물, 단량체 인테그레이스(monomeric integrase), DNA 올리고머 및 단백질 응집물이 포함된 현탁액으로 시작합니다.
PFV 인타좀(intasome)은 바이러스 게놈 DNA를 모방한 합성 올리고머와 복합체를 이룬 바이러스 인테그레이스(integrase)의 4량체입니다.
현탁액에 염 용액을 첨가하고 얼음 위에서 배양합니다. 염은 인타좀(intasome) 간의 정전기적 상호작용을 감소시켜 침전물이 용해되도록 합니다.
인타좀(intasome)의 용해를 촉진하기 위해 일정한 간격으로 부드럽게 피펫팅하십시오.
원심분리하여 남아있는 침전물을 가라앉히고, 가용성 인타좀(intasome)이 포함된 상층액을 수집합니다.
교차 결합된 아가로스 비드가 충진되어 미리 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 준비하고, 상층액을 컬럼에 로딩합니다.
단백질 응집체와 인타좀(intasome)은 크기가 크기 때문에 비드 기공을 통과하지 않고 더 빠르게 용출됩니다.
더 작은 단량체 인테그레이즈와 올리고머는 비즈 기공으로 들어가 더 늦게 용출됩니다.
이후의 하위 분석을 위해 인타솜(intasome)이 포함된 초기 용출 분획을 수집하십시오.
깨끗한 표면에서 새 면도날이나 메스 날을 사용하여 200 µL 팁의 끝부분에서 2~4 mm를 잘라내어 와이드 보어(wide-bore) 피펫 팁 두 개를 준비합니다. 투석 버퍼에서 투석 튜브를 꺼냅니다. 클립 근처의 튜브 끝부분에 남아 있을 수 있는 투석 버퍼로 인해 인타좀(intasome) 시료가 희석되는 것을 방지하기 위해, 작은 피펫 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 과잉의 투석 버퍼를 제거합니다.
투석 튜브의 이쪽 끝에서 클립을 제거하십시오. 복합체를 회수할 때는 용액과 침전물을 최대한 많이 수집하는 것이 중요합니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 투석 튜브 내부의 침전물을 포함한 샘플을 얼음 위에 놓인 1.5 milliliter 튜브로 옮기십시오.
회수된 물질의 총 부피를 확인하십시오. 총 부피는 일반적으로 약 140 µL입니다. 침전물이 포함된 샘플의 농도는 200 mM NaCl입니다.
스톡 5 M 염화나트륨 용액을 적절한 부피만큼 첨가하여 염 농도를 최종 농도 320 mM 염화나트륨으로 높입니다. 샘플이 담긴 아이스 버킷을 4 ˚C 저온실로 옮깁니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 피펫팅으로 침전물을 재현탁 및 가용화합니다.
최소 1시간 동안 20분마다 이 과정을 반복하십시오. 침전물의 대부분이 용액 속으로 녹아 들어가야 합니다. 인타좀(intasome)을 정제하려면, 0.4 mL/min의 유속으로 SEC 러닝 버퍼를 사용하여 가교된 아가로스 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 평형화하십시오.
잔류 침전물을 펠릿화하기 위해 intasome 샘플을 마이크로 원심분리기에서 14,000 ×g로 10분 동안 4 °C에서 원심분리하십시오. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 이를 200 µL 주입 루프(injection loop)에 로드하십시오. 샘플을 SEC 컬럼에 적용하십시오.
25 mL의 SEC running buffer로 용출하고 270 µL씩 95개의 분획을 수집합니다. SEC 크로마토그램에 세 개의 A280 및 A260 피크가 나타나는지 확인합니다.