실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위한 바이러스 RNA 추출

배양 배지에 희석된 합성 바이러스 RNA 표준 용액으로 시작하십시오.

이 희석액들은 시료 내의 바이러스 RNA를 정량화하기 위한 표준물질로 사용됩니다.

이제 바이러스에 감염된 세포 배양액에서 바이러스가 포함된 상층액을 취합니다.

이 배양 배지는 RNA 분해 효소에 결합하여 바이러스 RNA의 분해를 방지하는 억제제를 포함하고 있습니다.

proteinase K 효소가 포함된 처리 버퍼를 첨가합니다.

균일하게 섞이도록 용액을 짧게 원심분리합니다.

시료가 담긴 PCR 플레이트를 써모사이클러(thermocycler)에 넣습니다.

먼저, proteinase K를 활성화하기 위해 적당한 온도에서 배양합니다.

이 효소는 게놈을 캡슐화하고 있는 바이러스 단백질을 분해하여, 바이러스 RNA를 용액 속으로 방출시킵니다.

다음으로, 더 높은 온도에서 배양하여 효소를 불활성화하고 RNA를 변성시킵니다.

마지막으로, 실시간 정량 PCR 분석 전까지 처리된 시료를 저온 상태로 보관하십시오.

먼저, 199 µL의 처리 버퍼와 1 µL의 nuclease-free proteinase K를 혼합합니다. 세포 배양 배지를 사용하여, 피펫팅과 볼텍싱을 반복함으로써 준비된 뎅기 바이러스 3’UTR RNA를 1:10으로 단계 희석하여 5 x 10⁹에서 5 x 10³ copies/µL 농도 범위의 RNA 표준물을 얻습니다. 뎅기 바이러스 감염 세포의 배양 상층액 5 µL와 뎅기 바이러스 3’UTR RNA 표준물을 8-tube PCR 스트립 또는 96-well PCR 플레이트의 웰로 옮깁니다.

processing buffer와 proteinase K가 포함된 용액 5 μL를 혼합합니다. 200 ×g에서 5초간 짧게 원심분리합니다. 써모사이클러(thermocycler)를 사용하여 샘플을 25 °C에서 10분 동안, 이어서 75 °C에서 5분 동안 배양합니다.