인간 간암 세포로부터의 E형 간염 바이러스 입자 수확

바이러스 입자를 생성하기 위해 E형 간염 바이러스(HEV) RNA가 형질전환된 인간 간암 세포 배양물로 시작합니다.

일부 HEV는 숙주 유래 엔도솜 막을 획득하여 세포 밖으로 배출되는 반면, 다른 일부는 비외피 HEV 상태로 세포 내에 남아 있습니다.

세포 외 HEV를 수확하려면, 배양 상층액을 수집하고 여과하여 세포 부스러기를 제거하십시오.

감염력을 유지하기 위해 초저온에서 보관하십시오.

세포 내 HEV를 수확하려면, 버퍼로 세포를 세척합니다.

세포를 분리하기 위해 trypsin-EDTA를 첨가한 후, 효소 활성을 중단시키기 위해 배지를 첨가합니다.

현탁액을 튜브로 옮긴 후 원심분리합니다.

잔류 트립신이 포함된 상층액을 제거합니다. 펠릿을 재현탁하여 튜브로 옮깁니다.

세포를 액체 질소에 냉동한 후 얼음 위에서 해동합니다.

세포를 용해하여 바이러스를 방출시키기 위해 동결-해동 사이클을 반복합니다.

원심분리하여 바이러스가 포함된 상층액을 수집하고 초저온에서 보관하십시오.

6일째에, 상층액을 0.45 µm 메쉬 필터로 여과하여 세포 잔해를 제거하고, 수확한 세포 배양 유래 extracellular hepatitis E virus를 4 °C에서 보관하십시오. 세포 배양 유래 intracellular hepatitis E virus 입자를 수확하려면, PBS로 세포를 세척하고 37 °C에서 0.05% trypsin-EDTA 1.5 mL를 사용하여 세포를 분리하십시오. 세포가 분리되면 8.5 mL의 DMEM으로 반응을 중단시키고, 원심분리를 위해 세포 현탁액을 50 mL 튜브로 옮기십시오.

전기천공 1회당 1.6 mL의 DMEM 완전 배지를 개별 2 mL 반응 튜브에 넣고, 이 배지 중 80 µL를 사용하여 세포를 재부유시켜 튜브로 옮깁니다. 세포를 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, 얼음 위에서 세 번 해동하며 반복하고, 생성된 용해물을 10,0 ×g에서 10분 동안 고속 원심분리합니다. 그런 다음 세포 파편 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 새 튜브로 옮겨 -80 °C에서 보관합니다.