유정란 요막액으로부터의 바이러스 정제

바이러스에 감염된 유정란에서 수확한 요막액이 담긴 저장조부터 시작하십시오.

이 액체에는 바이러스 입자와 함께 숙주 유래 오염 물질이 포함되어 있습니다.

액체를 depth filter에 통과시켜 작은 오염 물질과 바이러스는 통과시키고 큰 오염 물질은 제거합니다.

그 다음, 여과된 액체를 여과 시스템에 로딩하여 막 표면을 따라 접선 방향으로 흐르게 합니다.

더 작은 오염 물질은 막을 통과하는 반면, 바이러스는 잔류하여 농축됩니다.

농축된 바이러스를 밀도 구배에 로딩하고 원심분리합니다. 바이러스는 자신의 밀도가 구배와 일치하는 지점에서 뚜렷한 밴드를 형성합니다.

바이러스가 풍부한 밴드를 투석 카세트에 수집하고 이를 완충액에 넣습니다. 반투과성 막을 통해 완충액의 물은 내부로 확산되어 들어오고, 밀도 구배 성분은 외부로 확산되어 나갑니다.

다음으로, 카세트를 고장성 용액에 넣어 수분을 제거하고 정제된 바이러스를 농축합니다.

Newcastle Disease Virus(NDV)를 정제하기 위해, 먼저 50 milliliters의 PBS를 흘려보내 이전에 설정한 실험 시스템을 프라이밍합니다.

튜브에 PBS가 약 5 mL 남았을 때 펌프를 정지하십시오. 다음으로, 1~3 µm의 정격 정지 크기를 가진 depth filter를 튜브에 연결하십시오. 필터를 통기시키기 위해 depth filter 상단의 두 번째 캡을 제거한 후, 시스템에 50 mL의 PBS를 추가로 흘려보내십시오.

PBS가 필터 상단의 환기구를 통해 흐르기 시작하면, 포트를 닫고 라인을 통해 PBS를 계속 흐르게 합니다. 그 후 폐액 용기를 새로운 멸균 수집 용기로 교체하고, depth filter를 통해 요막액을 통과시키기 시작합니다. 다음으로, 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 또는 TFF 시스템을 개방형 구조로 설정하고 원고에 기술된 대로 실행합니다.

저장조에 액체가 약 5 mL 남았을 때, 펌프를 일시 정지하고 depth 필터링된 요막액을 저장조에 추가하십시오. 그 다음 펌프 흐름을 재개합니다. 바이러스의 전단 응력을 방지하기 위해 시스템 압력이 10 pound force per square inch를 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다.

용출량을 늘리려면 연동 펌프의 속도와 C-클램프를 조합하여 사용해야 합니다. 저저조에 150 내지 100 mL의 요막액이 남았을 때, 펌프를 일시 정지하고 150 내지 200 mL의 ML 버퍼를 추가하여 버퍼를 교체합니다. 다시 저저조에 5 내지 10 mL의 액체가 남았을 때 펌프를 일시 정지한 다음, 두 개의 C-클램프를 사용하여 폐액 라인을 차단합니다.

저장조로 연결되는 농축액 라인을 분리하여 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 삽입합니다. 그 후 흐름을 재개하고, 저장조 탱크에 액체가 몇 방울 남았을 때 일시 정지합니다. 다음으로, 폐액 라인에서 C-클램프를 제거하고 농축액 공급 라인을 다시 저장조 탱크에 연결합니다.

그동안 iodixanol 밀도 구배 초원심분리를 준비하기 위해, 먼저 13.2 mL 개방형 박벽 초원심분리 튜브에 40% iodixanol 0.5 mL를 넣습니다. 그런 다음 20% iodixanol 2.5 mL와 10% iodixanol 2.5 mL를 순차적으로 추가하여 컬럼을 준비합니다. 초원심분리를 시작하기 전, 구배가 흐트러지지 않도록 TFF 시스템에서 용출된 바이러스 용액 6~6.5 mL를 iodixanol 컬럼에 조심스럽게 첨가합니다.

초원심분리 후, 멸균 집게를 사용하여 튜브를 꺼냅니다. 표적 밴드는 10%와 20% 농도 구배 사이에 형성된 커다란 밴드여야 합니다. 그다음, 레토르트 스탠드를 사용하여 비커 상단에 튜브를 고정합니다.

그 후, 18 gauge의 1.5인치 바늘을 5mL 시린지에 장착한 다음, 바늘로 초원심분리관의 측면을 뚫고 플런저를 천천히 밀어 대상 밴드를 제거합니다. 원고에 설명된 대로 바이러스 용액에서 iodixanol을 제거한 후, 시린지를 사용하여 바이러스를 투석 카세트에 조심스럽게 주입합니다. 바이러스 용액을 농축하려면, 투석 버퍼에서 투석 카세트를 꺼내 작은 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣습니다.

그런 다음 투석 카세트가 완전히 잠기도록 백에 40% polyethylene glycol 15~25 milliliters를 추가합니다.