센다이 바이러스 매개 인간 혈액 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍

인간 말초혈액 단핵구(PBMCs) 배양물을 준비합니다.

리프로그래밍 전사 인자를 인코딩하는 Sendai 바이러스를 추가합니다. 플레이트를 덮고 밀봉합니다.

바이러스와 세포의 접촉을 촉진하기 위해 원심분리하고 배양한다.

바이러스 융합 후, 바이러스 RNA는 전사 인자를 발현시켜 세포의 다능성 유전자를 활성화하고 계통 특이적 유전자를 억제함으로써 리프로그래밍을 개시합니다.

이 과정 동안, 형질도입된 PBMC의 일부가 유도만능줄기세포(iPSCs)로 전환되며 접착 단백질을 발현합니다.

이들을 매트릭스가 코팅된 웰로 옮기고 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 성장 배지로 교체합니다.

배양 후, iPSC는 매트릭스에 부착되는 반면, 형질전환된 비부착성 PBMC는 부유 상태로 유지됩니다.

부유물을 코팅된 웰로 옮기고 원심분리합니다. 원래의 웰에 배지를 추가하고 두 웰 모두 배양합니다.

남은 형질전환 PBMC는 리프로그래밍을 시작하여 iPSC로 전환되며 부착됩니다. 이 단계는 리프로그래밍된 세포의 회수율을 극대화합니다.

iPSC 성장을 유지하기 위해 매일 배지를 교체하십시오.

이 절차에서는 혈구 세포를 15-ml 원추형 튜브로 옮기고, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 형질도입을 위해 3 x 10⁵개의 세포를 준비하고, 상온에서 515 x g로 5분 동안 원심분리합니다.

그 후, 흡입기로 상층액을 제거하고 0.5 ml의 혈액 세포 배지에 세포를 재부유시킵니다. 그런 다음, 세포를 코팅되지 않은 24-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 얼음 위에서 Sendai 바이러스 혼합물을 해동하여 부유시킨 세포에 첨가합니다.

플레이트를 실링 필름으로 밀봉하고 30 °C에서 1,150 ×g로 30분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24-웰 플레이트에 비트로넥틴을 코팅하려면, 비트로넥틴 용액을 PBS로 희석하여 최종 농도가 5 µg/ml가 되게 합니다.

다음으로, 웰에 1 ml의 vitronectin을 넣고 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 그 후 코팅 용액을 제거하고, 세포와 바이러스가 포함된 모든 배지를 코팅된 웰로 옮깁니다. 그런 다음, 0.5 ml의 신선한 혈구 배지를 추가로 사용하여 남은 세포를 수집하고 이를 세포가 포함된 웰에 추가합니다.

그 후, 플레이트를 35 °C에서 1,150 ×g로 10분 동안 원심 분리하고, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 밤새(O/N) 배양합니다. 2차 세포 전이를 위해, 앞서 설명한 대로 웰을 5 µg/ml vitronectin으로 코팅합니다. 각 트랜스덕션(transduction)당 플레이트의 웰 하나를 사용하며, 첫 번째 플레이트에 있는 세포 현탁액을 새로 코팅된 vitronectin 플레이트로 옮깁니다.

그동안 유지 관리를 위해 첫 번째 플레이트의 웰에 iPSC 배지 1 ml를 첨가하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며 매일 신선한 iPSC 배지로 교체해 줍니다. 콜로니는 형질도입 후 14~21일 사이에 나타납니다. 부유 세포가 들어 있는 새로 코팅된 플레이트를 35 °C에서 1,150 x g로 10분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤(O/N) 동안 배양합니다. 다음 날, 상층액을 제거하고 신선한 유도만능줄기세포(iPSC) 배지로 교체합니다. 부착된 세포는 80% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하며 유지합니다.