0 조회수 • 3:41 분 • August 31st, 2026
인간 폐 상피 세포가 들어 있는 튜브를 준비하여 시작합니다.
비오틴화된 인플루엔자 바이러스를 첨가하고 얼음 위에서 배양합니다. 바이러스는 세포 내부로 유입되지 않고 세포 표면에 결합합니다.
원심분리를 통해 바이러스가 결합된 세포를 분리하고, 상층액을 제거한 후 재부유시킵니다.
최초 시간대 튜브에 비오틴화된 바이러스와 결합하여 복합체를 형성하는 표지되지 않은 streptavidin을 첨가합니다.
스트렙타비딘-비오틴 바이러스 복합체에는 결합하지 않는 형광체 표지 스트렙타비딘을 첨가합니다. 세포를 세척하고 고정합니다.
나중 시점의 튜브를 더 높은 온도에서 배양하여 바이러스 내재화를 유도한 후, 다시 얼음에 놓으십시오.
표지되지 않은 streptavidin과 바이러스의 추가적인 흡수를 방지하는 내부화 차단제를 첨가하고 배양합니다. Streptavidin이 표면에 결합된 biotinylated 바이러스에 결합하면 세척합니다.
세포를 고정하고 계면활성제가 포함된 완충액을 첨가하여 투과화합니다.
세척 후 형광 표지된 streptavidin을 첨가하면, 이것이 세포 내로 들어가 biotin과 결합합니다.
유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.
나중 시점에서 형광 강도가 더 높게 나타나면 바이러스의 내부화가 성공적으로 이루어졌음을 확인하는 것입니다.
세척 과정을 한 번 더 반복한 후, 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 냉각합니다. 튜브가 냉각되면 다시 원심분리하고, 감염용 PBS에 희석된 10 µL의 비오틴화 바이러스를 사용하여 얼음 위에서 1시간 동안 배양한 후 펠릿을 재현탁합니다. 다시 원심분리하고 PBS로 두 번 세척하며, 0분 시료의 경우 가능한 한 다음 시료들과 병행하여 처리합니다.
0분 및 STV 처리 시료를 처리하려면, 튜브를 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 15 µL의 2% BSA 및 0.1% sodium azide가 포함된 PBS 내 STV를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그다음 원심 분리하고, 앞서 시연한 대로 PFA로 고정시킨 후 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척하고, 시료를 4 °C에서 보관합니다.
30분 이상 STV를 처리한 샘플의 경우, 펠렛팅 후 37 °C에서 30분 동안 배양한 다음, 20 µL의 PBS 2% BSA에 샘플을 재부유시킵니다.
세포를 원심 분리한 후 50 µL의 STV 2% BSA 0.1% Sodium azide 함유 PBS에 재현탁하여 세척 및 고정 전 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 텍스트 프로토콜의 세부 사항에 따라 모든 샘플을 투과화하고 STV-Cy3로 염색한 뒤, 샘플을 4 °C에서 보관합니다. 마지막으로 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.