뉴클레오사이드 유사체를 이용한 복제 중인 HSV-1 게놈의 표지

DNA 복제가 최소화된 정지기 포유류 세포 배양물을 사용하여 배양 상층액을 수집합니다.

헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)를 첨가하고, 바이러스가 부착될 수 있도록 가끔 흔들어주며 배양합니다. 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거하고 조건화 배지를 다시 채워줍니다.

배양 후, 바이러스는 숙주 막과 융합하여 뉴클레오캡시드를 세포질로 방출합니다.

바이러스 dsDNA가 핵 내부로 들어가 원형화되며, 바이러스 DNA 복제를 위한 바이러스 단백질을 발현합니다.

바이러스 및 숙주 단백질이 바이러스 DNA를 풀어내고 RNA 프라이머를 합성합니다. 다음으로, 바이러스 DNA 중합효소 복합체가 결합하여 DNA 합성을 위해 프라이머를 연장합니다.

복제가 진행됨에 따라 배양액에 뉴클레오사이드 유사체를 첨가합니다. 이는 세포 내로 들어가 triphosphate 형태로 전환됩니다.

숙주 DNA 복제가 최소화되므로, 아날로그가 복제 중인 바이러스 DNA에 우선적으로 삽입되어 바이러스 게놈을 표지하게 됩니다.

표지된 바이러스 게놈은 연관 단백질의 후속 단백질체 분석을 위한 준비가 완료되었습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MRC-5 세포 배양부터 이 절차를 시작하십시오. 그런 다음, 차가운 tris-buffered saline 또는 TBS에 HSV-1을 희석하십시오. 다음 단계에서는 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 송풍기와 조직 배양 후드의 전원을 끄는 것이 중요합니다.

피펫을 사용하여 MRC-5 세포의 성장 배지를 멸균 병에 옮겨 담아 감염 후 세포에 다시 추가하십시오. 희석된 바이러스 7 mL를 세포에 첨가하여 세포를 감염시킵니다. 실온에서 1시간 동안 10분마다 세포를 흔들어 줍니다.

흡착 후, 접종액을 흡입하여 제거하고 상온의 TBS 50 mL로 세포를 헹군 다음 원래의 성장 배지를 다시 채웁니다. 그런 다음 5% 이산화탄소가 존재하는 37 °C에서 세포를 배양합니다. 바이러스 DNA 복제가 시작된 후, 감염 약 4시간 후에 복제 중인 바이러스 DNA를 라벨링합니다.

이를 위해, EdC를 1 mL의 성장 배지에 희석하여 감염된 세포의 세포 배양 배지에 추가하고 2~4시간 동안 처리합니다.