바이러스 DNA-단백질 복합체로부터의 단백질 분리

알킨(alkyne) 변형 뉴클레오타이드로 표지된 바이러스 게놈이 포함된 세포 핵을 준비합니다.

핵을 biotin-azide와 구리 이온의 혼합액에 현탁시킨 후 배양합니다.

구리 이온은 아지드기와 알킨기의 공유 결합을 돕습니다.

원심 분리 후 상층액을 제거합니다.

완충액에 다시 현탁하여 옮긴 후, 원심분리하여 펠릿을 형성합니다.

펠렛을 급속 냉동시킨 후 해동하여 용해를 돕습니다.

핵을 용해시키기 위해 재현탁하고 초음파 처리합니다.

원심분리하여 단백질-바이러스 DNA 복합체가 포함된 상층액을 수집합니다.

상청액을 필터링하여 오염 물질을 제거합니다.

여과액을 희석합니다.

streptavidin 코팅 자성 비드를 첨가하고 인큐베이션하여 비오틴화된 단백질-DNA 복합체와의 결합을 촉진합니다.

자기장을 가해 비드를 수집하고, 세척하여 오염 물질을 제거합니다.

세척 과정을 반복합니다.

용출 버퍼를 첨가하고 가열하여 단백질을 분리 및 변성시킵니다.

비드를 분리하고 용출액을 수집합니다.

분리된 단백질을 급속 냉동합니다. 추가 분석을 위해 초저온에서 보관하십시오.

PBS를 완전히 제거한 후, 10 mL 파이펫으로 5회 정도 부드럽게 파이펫팅하여 핵 펠렛을 10 mL의 클릭 반응 믹스에 재현탁합니다. 샘플을 4 °C에서 1시간 동안 회전시킨 후, 이전과 동일한 방법으로 핵을 펠렛화합니다.

클릭 반응 혼합물을 완전히 제거한 다음, 10 mL의 PBS에 펠릿을 부드럽게 재부유시키고 다시 원심분리하여 펠릿을 세척합니다. 이제 핵 펠릿을 1 mL PBS에 조심스럽게 재부유시키고 용액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 PBS를 완전히 제거하고 액체 질소에서 펠릿을 급속 냉동합니다.

이 시점에서 펠렛(pellet)을 -80 °C에서 보관하거나 절차를 계속 진행할 수 있습니다. 핵을 용해하고 DNA를 단편화하기 위해, 해동된 핵을 500 µL의 Buffer B1에 넣고 피펫팅하여 재현탁합니다. 이 현탁액을 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.

그 다음, 3mm 마이크로팁 프로브를 사용하여 40% amplitude에서 각 30초씩 총 6회 샘플을 초음파 처리합니다. 각 펄스 사이에 샘플을 최소 30초 동안 얼음 위에 둡니다. 초음파 처리 후 샘플은 탁하지 않고 투명해야 합니다.

4 °C에서 14,000 x G로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화합니다. 펠렛의 크기가 상당히 줄어들면, 상층액을 100 micron 세포 스트레이너로 여과하고 여과액을