바이러스 DNA-단백질 복합체로부터의 단백질 분리

알킨(alkyne) 변형 뉴클레오타이드로 표지된 바이러스 게놈이 포함된 세포 핵을 준비합니다.

핵을 biotin-azide와 구리 이온의 혼합액에 현탁시킨 후 배양합니다.

구리 이온은 아지드기와 알킨기의 공유 결합을 돕습니다.

원심 분리 후 상층액을 제거합니다.

완충액에 다시 현탁하여 옮긴 후, 원심분리하여 펠릿을 형성합니다.

펠렛을 급속 냉동시킨 후 해동하여 용해를 돕습니다.

핵을 용해시키기 위해 재현탁하고 초음파 처리합니다.

원심분리하여 단백질-바이러스 DNA 복합체가 포함된 상층액을 수집합니다.

상청액을 필터링하여 오염 물질을 제거합니다.

여과액을 희석합니다.

streptavidin 코팅 자성 비드를 첨가하고 인큐베이션하여 비오틴화된 단백질-DNA 복합체와의 결합을 촉진합니다.

자기장을 가해 비드를 수집하고, 세척하여 오염 물질을 제거합니다.

세척 과정을 반복합니다.

용출 버퍼를 첨가하고 가열하여 단백질을 분리 및 변성시킵니다.

비드를 분리하고 용출액을 수집합니다.

분리된 단백질을 급속 냉동합니다. 추가 분석을 위해 초저온에서 보관하십시오.

PBS를 완전히 제거한 후, 10 mL 파이펫으로 5회 정도 부드럽게 파이펫팅하여 핵 펠렛을 10 mL의 클릭 반응 믹스에 재현탁합니다. 샘플을 4 °C에서 1시간 동안 회전시킨 후, 이전과 동일한 방법으로 핵을 펠렛화합니다.

클릭 반응 혼합물을 완전히 제거한 다음, 10 mL의 PBS에 펠릿을 부드럽게 재부유시키고 다시 원심분리하여 펠릿을 세척합니다. 이제 핵 펠릿을 1 mL PBS에 조심스럽게 재부유시키고 용액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 PBS를 완전히 제거하고 액체 질소에서 펠릿을 급속 냉동합니다.

이 시점에서 펠렛(pellet)을 -80 °C에서 보관하거나 절차를 계속 진행할 수 있습니다. 핵을 용해하고 DNA를 단편화하기 위해, 해동된 핵을 500 µL의 Buffer B1에 넣고 피펫팅하여 재현탁합니다. 이 현탁액을 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.

그 다음, 3mm 마이크로팁 프로브를 사용하여 40% amplitude에서 각 30초씩 총 6회 샘플을 초음파 처리합니다. 각 펄스 사이에 샘플을 최소 30초 동안 얼음 위에 둡니다. 초음파 처리 후 샘플은 탁하지 않고 투명해야 합니다.

4 °C에서 14,000 x G로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화합니다. 펠렛의 크기가 상당히 줄어들면, 상층액을 100 micron 세포 스트레이너로 여과하고 여과액을 회수합니다. 그 다음, 여과된 상층액에 Buffer B2 500 µL를 첨가합니다.

비오틴화된 DNA를 스트렙타비딘 코팅 비드에 결합시키기 위해, 300 µL의 비드 슬러리를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 스트렙타비딘 자기 비드를 준비합니다. 샘플당 하나의 비드 튜브를 준비하십시오. 볼텍싱으로 재부유시킨 후, 자석을 이용해 비드를 분리하고 세척 버퍼를 흡입하는 방식으로 Buffer B2 1 mL를 사용하여 비드를 세 번 세척합니다.

그 다음, 세척된 비드에 샘플 900 µL를 추가합니다. 샘플의 나머지 부분은 입력 DNA 및 단백질 분리에 사용됩니다. 현탁액을 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키십시오.

다음 날, 샘플을 자석 마이크로 원심분리 튜브 랙에 넣고 상층액을 제거합니다. 비드들을 1 mL의 Buffer B2에 조심스럽게 재현탁한 후, 4 °C에서 5분 동안 회전 혼합합니다. 자석 마이크로 원심분리 튜브 랙을 사용하여 상층액을 다시 제거합니다.

이번에는 비즈를 1 mL의 Buffer B3에 부드럽게 재현탁하고 4 °C에서 5분 동안 회전 혼합합니다. 자석을 사용하여 비즈 혼합물에서 상층액을 제거한 후, DNA-단백질 복합체를 용출시키기 위해 비즈를 50 µL의 2x Laemmli sample buffer에 재현탁합니다. 다음으로, 샘플을 95 °C에서 15분 동안 가열합니다.

혼합물을 볼텍싱한 후 마이크로 원심분리기로 샘플을 빠르게 스핀 다운합니다. 샘플을 자석에 부착하고 용출액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 샘플을 급속 냉동하여 80 °C에서 보관합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 분석을 수행하십시오.