카테터 관련 요로 감염을 모델링하기 위한 3D 프린팅 실리콘 코팅 장치

멸균된 인간 소변이 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져갑니다.

테스트 웰에 박테리아를 접종합니다. 대조군 우물에는 소변만 포함되어 있습니다.

카테터 관련 요로 감염 중에 생물막이 형성되는 카테터의 내부 표면을 모방한 3D 프린팅된 실리콘 코팅 장치를 예로 들어 보겠습니다.

그것을 웰에 넣고 플레이트를 밀봉한 다음 배양합니다.

박테리아는 장치 표면에 부착되어 소변의 영양분을 활용하고 생물막을 형성합니다.

느슨하게 결합된 박테리아를 제거하기 위해 완충액으로 장치를 헹굽니다.

장치를 크리스탈 바이올렛이 들어 있는 멀티웰 플레이트에 넣어 생물막과 상호 작용하여 염색합니다.

물로 헹구고 말리십시오.

산성 용액이 들어 있는 멀티웰 플레이트에 장치를 담가 염료-생물막 상호 작용을 방해하고 염료를 용액으로 방출합니다.

분광 광도계를 사용하여 각 우물에서 용액의 흡광도를 측정합니다.

대조군 웰에 비해 테스트 웰의 흡광도가 높으면 장치의 생물막 형성이 확인되어 카테터 관련 요로 감염을 모델링하는 데 적합함을 나타냅니다.

시작하려면 풀링된 인간 소변 샘플을 얻으십시오. 135마이크로리터의 풀링된 인간 소변을 지정된 레이아웃에 따라 96웰 플레이트의 각 테스트 웰에 분취합니다.

각 테스트 웰에 15마이크로리터의 정규화된 하룻밤 박테리아 배양액을 접종하여 웰당 150마이크로리터의 최종 부피를 달성합니다. 후속 연속 희석 검증 단계를 위해 이 배양액의 최소 100마이크로리터를 예약하십시오.

150마이크로리터의 멸균 풀링된 인간 소변을 지정된 웰에 추가하여 음성 대조군 웰을 준비합니다.

이제 못을 해당 웰에 삽입합니다. 접시와 같은 높이가 될 때까지 못 뚜껑을 누르고 마이크로플레이트 뚜껑으로 고정하고 필요한 경우 테이프로 감습니다.

그런 다음 페그 모델을 광고가 들어 있는 밀봉된 플라스틱 통이나 가방에 넣습니다.amp 증발을 방지하기 위해 파란색 롤. 섭씨 37도에서 24시간 동안 정적으로 배양합니다.

접종 검증을 위해 예약된 배양액을 추가하기 전에 180마이크로리터의 PBS를 96웰 플레이트의 첫 번째 열의 행 2에서 6행까지 분취합니다.

이제 첫 번째 웰에서 두 번째 웰로 20마이크로리터를 옮기고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 초기 접종물이 최종 웰로 희석될 때까지 연속 희석을 계속합니다.

그런 다음 각 희석액에서 10마이크로리터 스팟을 적절한 고체 배지에 세 번씩 도금합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 부양한 후 각 지점에서 군집을 세십시오.

생물막 정량화를 위해 마이크로플레이트에서 페그 모델을 제거하고 페그가 위를 향하도록 화염 아래 또는 미생물 안전 캐비닛 내부에 뒤집습니다. 사용한 마이크로플레이트는 폐기하십시오.

페그 뚜껑을 멸균 PBS의 180마이크로리터 분취량이 들어 있는 신선한 마이크로플레이트로 옮겨 부착되지 않은 세포를 헹굽니다.

다음으로, 무균 상태로 작업하면서 멸균 유리 시험관 랙을 벤치에 놓고 페그 뚜껑을 고정하는 장착된 랙 상단을 부착합니다.

마이크로피펫을 사용하여 600마이크로리터의 멸균 PBS를 각 시험관에 분취합니다. 이제 페그 뚜껑을 랙에 삽입하고 페그가 시험관과 정렬되었는지 확인합니다. 뚜껑에서 오토클레이브 테이프를 제거합니다.

멸균 겸자를 사용하여 뚜껑을 통해 각 못을 바로 아래 시험관으로 밀어 넣습니다. 그런 다음 시험관 캡을 교체하고 각 튜브를 60초 동안 소용돌이쳐 생물막 관련 세포를 제거합니다.

각 와류 튜브에서 100마이크로리터를 제거하고 이전에 수행한 것과 같이 멸균 PBS에서 연속 희석을 수행합니다.

세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하려면 부피당 0.1% 중량의 크리스탈 바이올렛 180마이크로리터를 멸균 증류수에 96웰 플레이트의 24개 테스트 웰에 피펫팅합니다. 헹군 페그 모델을 해당 웰에 삽입하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.

염색 후 플레이트에서 페그 모델을 제거하고 사용한 플레이트를 폐기합니다. 깨끗한 욕조에서 흐르는 수돗물에 페그 모델 전체를 부드럽게 교반하면서 헹굽니다.

2회 더 세탁한 후 페그 모델을 뒤집고 실온에서 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 180마이크로리터의 30% 아세트산을 새로운 96웰 플레이트에 추가합니다. 건조된 페그 모델을 해당 웰에 삽입합니다.

배양이 완료되면 마이크로플레이트에서 페그 모델을 제거합니다. 마이크로플레이트 리더 또는 분광 광도계를 사용하여 540나노미터에서 염색된 웰의 광학 밀도를 측정합니다.