염화세슘 기반의 게놈 함유 아데노바이러스 벡터 정제

아데노바이러스에 감염된 포유류 세포로 시작합니다.

반복적인 동결-해동 사이클을 수행하여 세포를 용해하고 비리온을 방출시킵니다.

용해물을 원심분리하여 찌꺼기를 침전시킵니다. 바이러스 입자가 포함된 상층액을 수집합니다.

밀도 기반 분리를 위해 바이러스 상층액을 단계별 cesium chloride 구배 위에 층을 이루도록 쌓습니다.

바이러스 입자들이 부력 밀도에 따라 이동할 수 있도록 초원심분리기를 사용합니다.

전체 아데노바이러스 게놈을 포함하는 온전한 비리온은 패키징된 DNA로 인해 밀도가 더 높으므로 더 낮은 밴드로 가라앉으며, 상대적으로 가벼운 빈 캡시드와 잔해는 상층부에 남게 됩니다.

상층부를 제거합니다. 게놈을 포함하는 비리온이 형성된 하단 밴드를 수집합니다.

균일 밀도의 cesium chloride에 비리온을 재현탁하고 다시 초원심분리하여 분리를 정밀화하고 완전한 입자를 농축합니다.

상층액은 버리고 하단 밴드를 회수합니다.

세슘 클로라이드를 제거하기 위해 샘플을 투석하십시오.

이제 고순도의 게놈 함유 아데노바이러스 벡터를 하위 응용 단계에 사용할 준비가 되었습니다.

세슘 클로라이드 밀도 구배 정제를 위해 바이러스 용해물을 준비하려면, 세포-바이러스 현탁액을 4회 동결 및 해동하십시오. 그 다음, 바이러스 용해물을 실온에서 500 ×g로 8분 동안 원심분리하십시오.

그 다음, 고용량 아데노바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다. 다음과 같은 순서로 세슘 클로라이드 용액을 튜브에 조심스럽고 천천히 피펫으로 분주합니다: 1.5 g/cm³ 용액 0.5 mL, 1.35 g/cm³ 용액 3 mL, 그리고 1.25 g/cm³ 용액 3.5 mL. 1.25 g/cm³ 층 위에 정제된 벡터 상층액 약 4.5 mL를 층을 이루도록 올립니다.

고용량 아데노바이러스 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 빈 입자 및 세포 잔해로부터 분리하기 위해, 스윙 아웃 로터를 사용하여 12 °C에서 226,000 ×g로 최소 2시간 동안 초원심분리기로 밀도 구배 원심분리를 수행합니다. 원심분리가 끝나면 튜브 상단에 세포 잔해의 확산 밴드가 형성되며, 그 아래로 두 개의 흰색 밴드가 관찰될 수 있습니다.

상단 밴드에는 빈 입자가 포함되어 있으며, 하단 밴드는 고용량 아데노바이러스입니다. 세포 파편과 빈 입자 층을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음, 각 튜브의 하단 밴드에서 1 mL를 수집하십시오.

바이러스를 멸균된 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 수집된 바이러스 입자에 1.35 grams per cubic centimeter cesium chloride 용액을 최대 24 milliliters까지 첨가하고 조심스럽게 혼합합니다. 원심분리 튜브 상단까지 1.35 grams per cubic centimeter cesium chloride 바이러스 용액을 채웁니다.

그 다음, 저속 가속 및 감속 설정이 적용된 스윙 아웃 로터를 사용하여 초원심분리기에서 12 °C의 온도로 226,000 ×g에서 하룻밤 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 새로운 피펫 팁을 사용하여 뚜렷하게 나타나는 하단 밴드에 존재하는 고용량 아데노바이러스를 수집합니다.

마지막으로, 수집된 바이러스 입자를 투석하여 완충액을 교체합니다. 그런 다음, 서면 프로토콜의 상세 지침에 따라 최종 준비물의 역가를 측정합니다.