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동결 매질에 임베딩되어 있으며 인간 간세포를 포함하고 있는 동결된 재세포화 쥐 간 조직으로 시작합니다.
이 조직에서 형질전환된 간세포는 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 리포터 단백질인 에메랄드 녹색 형광 단백질(EmGFP)을 발현합니다.
크라이오톰(cryotome)을 사용하여 세포 및 조직 구조가 유지되도록 얇은 절편을 제작합니다. 제작된 절편을 슬라이드로 옮깁니다.
세포막을 투과성으로 만들기 위해 절편을 약한 세제로 처리합니다.
형질전환된 세포에서 발현된 형광 리포터 단백질에 특이적으로 결합하는 anti-EmGFP 1차 항체를 처리합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척합니다.
1차 항체에 결합하는 적색 형광체 결합 2차 항체를 처리한 후 세척합니다.
세포 DNA에 결합하는 DNA 특이적 청색 형광 염료를 첨가하십시오.
형광 현미경 하에서 적색 형광과 청색으로 염색된 핵의 공국소화(colocalization)를 통해, 간 조직 내의 형질전환된 간세포가 바이러스 리포터 단백질을 성공적으로 발현함을 확인할 수 있습니다.
메스를 사용하여 각 간 엽에서 두께 약 0.5 cm, 길이 1.5~2 cm의 샘플을 절편합니다. 절편된 샘플을 4% sucrose가 포함된 4% paraformaldehyde 용액에 넣고 4 °C에서 90분 동안 배양합니다.
그런 다음 샘플을 PBS로 1분씩 3회 세척합니다. 세척 후 샘플을 8% sucrose에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 고정액이 담긴 cryomold에 샘플을 넣습니다.
기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 샘플을 넣은 후, 고정액으로 샘플을 완전히 덮고 -80 °C에 보관하십시오. 샘플이 동결되면, 크라이오톰을 사용하여 10 µm 두께의 냉동 절편을 제작하십시오.
재세포화를 확인하기 위해 필요에 따라 샘플을 염색하십시오.