0 조회수 • 3:33 분 • August 31st, 2026
인체 세포 배양물을 준비합니다.
오퍼레이터와 융합된 테트라사이클린 반응성 프로모터 하에서 조건부 호스트 mRNA 표적 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스를 첨가한다.
렌티바이러스는 또한 구성적 프로모터(constitutive promoter) 하에 배치된 테트라사이클린 억제제 및 항생제 내성 단백질 유전자도 함께 운반합니다.
바이러스 RNA가 숙주 세포 내로 전달될 수 있도록 배양합니다.
RNA가 cDNA로 전환되어 숙주 게놈에 통합됩니다.
세척 후 배지를 첨가하고 배양하여 테트라사이클린 억제(tetracycline repressor)와 항생제 내성 단백질이 발현되도록 함으로써 형질도입된 세포를 생성합니다. 테트라사이클린 억제는 오퍼레이터(operator)에 결합하여 shRNA 발현을 억제합니다.
세척 후 항생제가 첨가된 배지를 넣고 배양합니다.
형질전환된 세포는 항생제 내성 단백질을 발현하여 항생제가 존재하는 환경에서 선택적으로 생존할 수 있습니다.
테트라사이클린 유사체인 doxycycline을 배양액에 첨가합니다.
Doxycycline이 tetracycline repressor에 결합하여 operator에 대한 결합을 방지함으로써 shRNA 발현을 가능하게 합니다.
shRNA는 siRNA로 가공되어 RISC에 로딩되며, 이를 통해 표적 mRNA를 분해합니다.
이를 통해 doxycycline 의존성 조건부 넉다운 세포를 생성합니다.
안정적 세포주를 생성하려면, 먼저 12-well 플레이트에 HCT-16 대장암 세포와 MDA-MB-231 유방암 세포를 웰당 50,0 cells씩 분주합니다.
37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 세포의 합류도가 60-70%에 도달하면, PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 바이러스가 포함된 배지 1 mL를 첨가합니다. 다음 날, 흡입법을 통해 바이러스가 포함된 배지를 조심스럽게 제거합니다.
그런 다음 PBS로 세포를 세척한 후, tetracycline-free FBS가 포함된 배지를 첨가합니다. 72시간 후, 이전과 동일하게 세포를 세척하고 바이러스 형질전환 세포의 선택을 위해 1 µg/mL puromycin이 첨가된 배지를 넣습니다. puromycin이 존재하는 조건에서 3~14일 동안 세포를 배양하여 바이러스 형질전환 세포를 선택합니다.
바이러스가 형질전환된 세포가 있는 웰에서 puromycin에 의한 세포의 부분적인 사멸을 관찰하십시오. 형질전환되지 않은 세포는 puromycin 존재 하에서 성장하지 않습니다.
다양한 농도의 doxycycline이 포함된 배지를 추가하고 72시간 동안 세포를 배양하여, puromycin 내성을 가진 HCT-16 대장암 세포 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 조건부 knockdown의 효율을 확인합니다.