단계적 수크로오스 원심분리를 이용한 바이러스 농축 현탁액 제조

수크로스 밀도 구배가 포함된 초원심분리 튜브로 시작하십시오.

바이러스가 포함된 상층액을 그 위에 조심스럽게 첨가합니다.

농도 구배를 유지하기 위해 가속 및 감속을 제어하여 원심분리함으로써, 회전 중에 입자들이 자신의 부력 밀도와 일치하는 층에 가라앉도록 합니다.

가벼운 단백질은 상층에 남습니다. 온전한 바이러스 입자는 저밀도 층과 고밀도 층 사이에 농축되며, 더 무거운 세포 파편은 바닥에 가라앉습니다.

상층액은 버리고, 바이러스가 농축된 중간층의 sucrose 분획을 새 튜브에 수집하십시오.

완충액을 첨가하고 샘플을 여러 번 혼합합니다.

다음으로, 깨끗한 튜브에 담긴 저밀도 sucrose cushion 위에 바이러스 현탁액을 조심스럽게 층으로 쌓습니다.

현탁액을 원심분리합니다. 무거운 바이러스 입자는 바닥에 가라앉고, 가벼운 오염 물질은 상층액에 남게 됩니다.

상층액을 버립니다. 튜브를 페이퍼 타월 위에 거꾸로 세워 남은 액체를 제거합니다.

바이러스 펠릿을 완충액에 재현탁합니다.

바이러스가 농축된 현탁액이 후속 연구를 위해 준비되었습니다.

원추형 초원심분리관에 서로 다른 농도의 sucrose를 채워 sucrose 구배 층을 형성합니다.

바이러스가 포함된 상층액을 sucrose gradient에 조심스럽게 추가합니다. 100 mL의 바이러스 상층액 전체를 처리하려면, 매 회전 시 6개의 초원심분리 튜브를 사용하십시오. 그다음, 1X PBS 버퍼로 초원심분리 튜브의 균형을 맞추고, 샘플을 17 °C에서 70,000 g로 2시간 동안 원심분리합니다.

깨끗한 튜브에 30% 및 60% sucrose 분획을 수집하고, 차가운 1X PBS 버퍼를 추가하여 부피를 100 milliliters로 조정합니다. 피펫팅을 여러 번 반복하여 샘플을 혼합합니다. 그 다음, 1X PBS 용액에 녹인 20% sucrose 4 milliliters 위에 바이러스 용액 20에서 25 milliliters를 추가하여 sucrose cushion을 준비합니다.

튜브가 전체 용량의 4분의 3 미만으로 채워진 경우, 멸균 1X PBS 완충액으로 부피를 조절하고 균형을 맞춥니다. 그런 다음, 17 °C에서 2시간 동안 샘플을 원심분리합니다. 이후 상층액을 따라내고, 튜브를 종이 타월 위에 뒤집어 놓아 남은 액체를 제거합니다.

마지막으로 남은 방울들까지 흡입하고 나면, 바이러스가 포함된 펠렛이 반투명한 점 형태로 희미하게 보입니다. 다음으로, 현탁액을 충분히 파이펫팅하여 70 µ