0 조회수 • 3:51 분 • August 31st, 2026
검출에 사용되는 단백질 마커인 HIV-1 p24 항원을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 준비합니다.
p24을 용해하고 방출시키기 위해 계면활성제를 첨가한 후, 샘플을 단계적으로 희석합니다.
anti-p24 단클론 항체와 비특이적 결합을 방지하기 위한 블로킹 제제가 코팅된 마이크로플레이트를 준비합니다.
시료 희석액과 p24 표준물질을 참조용으로 첨가합니다.
p24이 특정 에피토프를 통해 항체와 상호작용할 수 있도록 배양한 후, 결합되지 않은 성분들을 제거합니다.
p24의 서로 다른 에피토프에 결합하는 anti-p24 다클론 항체와 함께 배양합니다. 결합되지 않은 항체는 모두 제거합니다.
다클론 항체에 결합하는 peroxidase 연결 항체를 첨가하십시오. 결합되지 않은 항체는 제거하십시오.
색깔이 있는 생성물로 변환되는 페록시다제 기질을 첨가합니다.
과산화효소를 불활성화하고 생성물을 안정화하기 위해 산을 첨가합니다.
p24 농도에 비례하는 색 강도에 해당하는 흡광도를 측정합니다.
표준 곡선을 작성하고 샘플 농도를 추정하여 바이러스 역가를 결정합니다.
NIH AIDS 백신 프로그램의 HIV-1 p24 항원 캡처 분석 키트에 따라, 1:1,50로 희석한 모노클로날 anti-p24 항체 100 µL를 high-binding 96-well 플레이트에 코팅합니다. 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, cold PBS 내 0.05% TWEEN-20 20 µL로 플레이트를 3회 세척합니다.
비특이적 결합을 방지하기 위해, 실온에서 1시간 동안 20 µL의 1% bovine serum albumin으로 플레이트를 블로킹합니다. 그 후, 차가운 PBS에 0.05% TWEEN-20을 포함한 용액 20 µL로 플레이트를 3회 세척합니다. 이어서, 벡터를 2차 증류수와 Triton X-10으로 희석하여 농축 및 비농축 벡터 샘플의 최종 농도가 10%가 되도록 준비합니다.
다음으로, 5 ng/mL에서 시작하여 2배 연속 희석법을 사용하여 HIV-1 표준물을 준비합니다. 농축 및 비농축 벡터 샘플을 희석한 후, 이를 플레이트에 3회 반복하여 분주하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트를 세척한 후 각 웰에 10 µL의 다클론 토끼 anti-p24 항체를 첨가하고 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다.
6회 세척 후, goat anti-rabbit horseradish peroxidase와 함께 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 여러 번 세척한 후, TMB peroxidase substrate와 함께 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 반응을 중단시키기 위해 1 N HCl을 첨가합니다. 그리고 흡광도 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정합니다.