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미생물학
0 조회수 • 2:44 분 • August 31st, 2026
영양 배지에 부유시킨 플라스미드 혼합물을 준비하여 시작합니다.
첫 번째 플라스미드는 목적 유전자를 인코딩하는 재조합 아데노 부속 바이러스(AAV) 게놈을 운반합니다.
두 번째 플라스미드는 Rep 및 Cap 단백질을 인코딩합니다.
세 번째 플라스미드는 헬퍼 단백질을 인코딩합니다.
플라스미드 용액에 트랜스펙션 시약을 추가합니다. 잘 섞은 후 인큐베이션합니다.
양전하를 띠는 transfection 제제가 음전하를 띠는 plasmid DNA와 결합하여 복합체를 형성합니다.
포유류 세포 단일층에 복합체를 도입합니다. 배양합니다.
복합체는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포 내로 들어갑니다.
세포 내에서 플라스미드에 인코딩된 유전자가 바이러스 단백질의 발현을 유도합니다.
Rep 단백질은 바이러스 게놈을 복제하고, Cap 단백질은 캡시드 껍질을 형성합니다.
Rep 단백질은 헬퍼 단백질과 함께 복제된 바이러스 게놈을 캡시드 내로 패키징하여 완전한 AAV 입자를 형성합니다.
관심 유전자를 포함하는 재조합 AAV 벡터가 유전자 전달 응용을 위해 준비되었습니다.
텍스트 프로토콜에 따라 rAAV9 컨스트럭트를 생성하고 HEK293 세포를 배양한 후, 1일 차에 세포를 트랜스펙션하려면 AAV Rep-Cap 플라스미드 70 µg, rAAV9 플라스미드 70 µg, Ad helper 플라스미드 200 µg을 50 ml 원심분리 튜브에 혼합합니다. 튜브에 FBS가 없는 상온의 DMEM 49 ml를 첨가하고 잘 섞습니다. 그런 다음, PEI 대 DNA 비율을 4:1로 만들기 위해 튜브에 PEI 1,360 µL를 첨가하고 잘 섞습니다.
용액을 상온에서 15분에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 150-mm 디쉬의 세포에 용액 5 ml를 첨가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 50시간에서 72시간 동안 배양합니다.