형질전환된 인간 신장 세포로부터의 재조합 바이러스 입자 정제

세포 단백질 및 바이러스 입자와 응집된 세포 DNA를 포함하는 세포 용해물로 시작합니다.

마그네슘 이온을 첨가한 후 뉴클레아제를 추가하여, 세포 DNA의 효소적 분해를 활성화하고 DNA-단백질 응집체를 해체합니다.

원심분리하여 찌꺼기를 분리하고 바이러스 입자가 포함된 상층액을 수집합니다.

상층액을 위에서 아래로 농도가 증가하는 불연속 iodixanol 구배 위에 층을 쌓은 다음, 튜브의 나머지 부분을 버퍼로 채웁니다.

밀도에 따라 성분을 분리하기 위한 초원심분리기입니다. 바이러스 입자는 고밀도 층과 중밀도 층 사이의 계면에 축적됩니다.

이 인터페이스 지점에 바늘을 삽입하고 바이러스 입자를 튜브에 수집합니다.

바이러스 입자의 응집을 방지하기 위해 안정화 성분이 포함된 버퍼를 첨가합니다.

그 다음 용액을 멤브레인 필터가 포함된 튜브로 옮깁니다.

원심분리하여 필터 위에 바이러스 입자를 농축합니다.

안정화제 보충 버퍼를 추가하고 다시 원심분리하여 정제된 바이러스 입자를 얻습니다.

형질전환된 세포를 수확하려면, 배양액을 사용하여 피펫으로 상하로 섞어 세포를 떼어내어 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 멸균된 50-밀리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 50 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

그 다음 각 튜브에 5 mL의 PBS를 넣고 세포 펠렛을 재현탁한 후, 모든 현탁액을 하나의 50 mL 튜브에 합칩니다. 세포를 50 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. AAV를 정제하기 위해 펠렛을 10 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁합니다.

용해물을 -80 °C 또는 드라이아이스-에탄올 배스에서 동결시킵니다. 그 다음 37 °C에서 해동합니다. 용해물을 1분 동안 볼텍싱한 후, 동결 및 해동 과정을 두 번 더 반복합니다.

다음으로, 해동된 용해물에 1 mM 염화마그네슘을 첨가합니다. 그런 다음 뉴클레아제(nuclease)를 최종 농도가 250 units/mL가 되도록 첨가합니다. DNA-단백질 응집체를 용해시키기 위해 해당 용액을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

시료를 4,800 ×g, 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 수집합니다. 한편, 17% iodixanol 구배 용액을 준비하려면, 10X PBS 5 mL에 1 M 염화마그네슘 0.05 mL, 1 M 염화칼륨 0.125 mL, 5 M 염화나트륨 10 mL, 그리고 밀도 구배 배지 12.5 mL를 혼합합니다.

증류수를 사용하여 총 부피를 50 milliliters로 맞춥니다. 텍스트 프로토콜에 따라 25%, 40%, 60% 구배 용액을 준비한 후, 바늘과 주사기를 사용하여 폴리프로필렌 튜브에 17% 구배 용액 5 milliliters를 주입합니다. 이어서 25%, 40%, 60% 구배 용액을 각각 5 milliliters씩 순서대로 주입합니다.

용해물을 밀도 구배 위에 층을 이루도록 올립니다. 그다음 튜브를 용해 버퍼로 채우고 코르크로 덮습니다. 밀도 구배를 185,0 ×g, 16 °C에서 90분 동안 원심 분리합니다.

원심분리가 끝나면, 21-gauge 바늘을 40%와 60% 층의 경계면에 삽입하여 40% 바이러스 분획을 시린지로 수집하며, 이때 25% 층은 완전히 피해야 합니다. 수집한 바이러스 분획을 멸균된 polyoxyethylene polyoxypropylene 또는 PEG-PPG 블록 공중합체 PBS 용액과 혼합하여 최종 부피를 15 milliliters로 맞춥니다. 이 혼합물을 분자량 컷오프 10 kilodaltons인 필터 튜브에 넣습니다.

그런 다음 시료를 2,0 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리하십시오. 튜브 바닥의 용액을 따라내십시오. 그 후 PEG-PPG를 사용하여 필터 튜브를 15 mL까지 다시 채우십시오.

튜브를 2,0 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리하십시오. 리필과 스핀 과정을 두 번 더 반복한 후, 필터 위에 남아 있는 정제된 rAAV9 바이러스 분획을 수집하십시오.