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미생물학
0 조회수 • 3:07 분 • August 31st, 2026
바이러스 온코진(oncogenes)과 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 입자가 포함된 배지를 준비합니다.
배지를 원심분리하여 세포 잔해를 제거합니다.
바이러스 입자가 포함된 상층액을 수집하여 내피세포 배양물 위에 덮어줍니다.
바이러스가 진입할 수 있도록 배양합니다.
바이러스 RNA는 DNA로 역전사되며, 이는 호스트 게놈에 통합됩니다.
항생제 내성 유전자는 내성 단백질을 생성합니다. 온코진(oncogene)은 세포 분열을 조절하는 종양 억제 단백질에 결합하여 이를 비활성화함으로써 세포 수명을 연장시키는 단백질을 생성합니다.
배지를 신선한 배지로 교체합니다.
바이러스 DNA의 안정적인 통합을 보장하기 위해 다시 배양합니다.
배지를 제거하고 세포를 세척하십시오.
세포를 분리하기 위해 효소 해리 용액을 첨가합니다.
세포 현탁액을 옮긴 후 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
펠릿을 재부유시켜 플라스크로 옮깁니다.
배지에 항생제를 추가하십시오.
항생제 내성 단백질을 발현하는 세포만이 생존하며, 이를 통해 바이러스 온코진 단백질에 의해 불멸화된 세포를 선택합니다.
하룻밤 동안 배양한 후, PA317 세포 배양액을 수집하고 상온에서 300 × g로 5분간 원심분리하여 정제합니다. 50% 합류도(confluence)에 도달한 혈관 내피세포 배양액의 EGM 배지를 정제된 PA317 배지 12 mL로 교체합니다. 세포를 4시간 동안 배양합니다.
그런 다음 PA317 배지 6 mL를 신선한 EGM 배지 6 mL로 교체하고 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 혈관 내피 세포 배양액에서 배지를 제거하고 신선한 EGM 12 mL를 공급합니다. 세포를 48시간 더 배양합니다.
혈관 내피세포를 계대 배양하려면, 배지를 제거하고 양이온이 없는 PBS 12 mL로 세포를 세척합니다. 그다음 상용 효소 해리 용액 3 mL를 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 세포 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 300 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다.
펠렛을 형성한 후, 세포를 신선한 EGM 배지로 재부유시키고 부유액을 세 개의 T75 플라스크에 균등하게 나눕니다. 배양액의 부피를 플라스크당 12 milliliters의 EGM으로 조정합니다. 그런 다음, 형질전환된 혈관 내피 세포를 선택하기 위해 200 micrograms per milliliter의 G418을 첨가합니다.