형광 인시튜 하이브리드법(FISH)을 이용한 숙주 세포 내 바이러스 RNA 분포 측정

바이러스 RNA가 핵과 세포질 구획 사이에 분포되어 있고 투과화 처리가 된 바이러스 감염 숙주 세포가 포함된 슬라이드로 시작합니다.

전하이브리드화 완충액을 첨가하고 습윤 조건에서 배양합니다.

완충액 내의 블로킹 시약은 비특이적 결합 부위를 차단하며, RNase 억제제는 RNase를 불활성화하여 RNA의 무결성을 유지합니다.

버퍼를 제거하고 바이러스 RNA에 상보적인 변성된 digoxigenin 표지 올리고뉴클레오타이드 프로브를 첨가합니다.

프로브-RNA 하이브리드화가 일어날 수 있도록 암소에서 배양한 후, 반복해서 세척하십시오.

고정액을 첨가하여 프로브-RNA 하이브리드를 안정화한 다음, 반복해서 세척합니다. 세포 투과성을 유지하기 위해 계면활성제가 첨가된 완충액을 넣습니다.

디곡시게닌(digoxigenin)과 상호작용하는 녹색 형광체 결합 항-디곡시게닌 항체를 첨가한 후, 반복해서 세척합니다.

복합체를 보존하기 위해 세포를 고정한 후, 다시 세척하십시오.

핵을 염색하기 위해 DNA 결합 염료를 첨가하십시오. 과량의 염료를 반복해서 세척하십시오.

커버슬립으로 마운트하고 밀봉합니다.

공초점 현미경 하에서 숙주 세포의 핵과 세포질 사이에 분포하는 바이러스 RNA를 나타내는 녹색 형광을 관찰하십시오.

시연된 것과 같이 PBS로 3회 세척한 후, 두 번째 투과화 단계 이전에 시료를 PBS 내 4% formaldehyde로 10-15분 동안 다시 고정합니다. 그런 다음 형광 신호를 보존하고 광퇴색을 방지하기 위해 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮습니다.

그 다음 세포를 2x saline sodium citrate로 세척하고, 45 µL의 hybridization solution을 처리합니다. 습윤 챔버 내 37 °C에서 1시간 동안 반응시킨 후, 대상 antisense oligonucleotides에 증류수를 추가하여 변성 부피를 10 µL로 맞춥니다. oligonucleotides를 95 °C에서 5분 동안 변성시킨 후, 슬라이드당 35 µL의 신선한 hybridization solution을 추가합니다.

그런 다음 샘플을 호일로 감싸 보호한 상태로 습윤 챔버 내 37 °C에서 10-24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 2X saline sodium citrate로 10분씩 두 번 세척한 후, 25 °C에서 1X saline sodium citrate로 10분 동안 한 번 더 세척합니다.

마지막 세척 후, 얼음 위에서 미리 냉각시킨 PBS 내 4% formaldehyde로 10-15분 동안 세포를 고정한 다음, 신선한 PBS로 세 번 세척합니다. 다음으로, 시연된 바와 같이 샘플을 투과화하고, anti-digoxigenin-FITC 및 미리 냉각시킨 PBS 내 0.1% BSA와 함께 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 종료 후, 슬라이드를 신선한 PBS로 세 번 세척하고, 미리 냉각시킨 PBS 내 4% paraformaldehyde로 4°C에서 10-15분 동안 샘플을 고정합니다.

PBS로 3회 세척한 후, 0.4 µg/mL의 DAPI와 얼음 위에서 미리 냉각시킨 0.5% Triton-X in PBS를 사용하여 15분 동안 얼음 위에서 핵을 염색하고, 이어서 PBS로 최종 3회 세척합니다. 실험적 필요에 따라 형광 비드를 포함하여 적절한 봉입제(mounting medium)로 슬라이드를 봉입합니다. 멸균 와이프로 과잉의 봉입제를 제거한 후, 투명 매니큐어를 여러 번 덧발라 각 슬라이드의 커버슬립을 밀봉하고, 형광 현미경을 사용하여 실험이 성공적으로 수행되었는지 확인합니다.

그 후 공초점 현미경을 사용하여 마운팅 후 1시간에서 1주일 이내에 630배 배율로 샘플 이미지를 획득할 수 있습니다.