전사체 분석을 위한 프로파지 용균 복제 유도

파지 억제 단백질에 의해 억제되어 휴면 상태의 용원성 단계를 유지하는, 통합된 프로파지 게놈을 보유한 박테리아 배양액으로 시작하십시오.

유도제를 첨가하고 진탕 배양하여 세포 스트레스를 유도합니다.

세포 스트레스는 억제 단백질의 자가 절단을 유도하며, 이를 통해 프로파지가 용원성 주기에서 용균성 복제로 전환되도록 합니다.

프로파지 DNA가 세균 게놈에서 절단되어 나오고, 초기 조절 유전자, 중간 DNA 복제 유전자, 그리고 후기 구조 및 용해 유전자를 순차적으로 전사합니다.

유도제를 희석하기 위해 배양액을 대용량의 배지로 옮기고, 세포가 회복될 수 있도록 배양합니다.

정해진 시간 간격으로 정지 용액(stop solution)을 첨가하여 전사를 중단시키고 박테리아 세포 내의 RNA 프로필을 보존합니다.

배양액을 원심분리하고 상층액을 제거하십시오. 세포를 재현탁하여 현탁액을 작은 튜브로 옮긴 후 원심분리하십시오.

상층액을 제거하고 펠렛을 급속 냉동하여 RNA 무결성을 유지합니다.

마지막으로, RNA 추출 시약을 첨가하고 균질화하여 세포를 파쇄합니다. 이제 샘플을 RNA 분리 및 후속 전사체 분석에 사용할 준비가 되었습니다.

다음으로, 80 mL의 배양이 들어있는 유도 표기 플라스크에 norfloxacin을 최종 농도 1 µg·mL⁻¹가 되도록 첨가합니다. 잘 섞어준 후 37 °C에서 180 rpm으로 진탕 배양하며 1시간 동안 배양합니다. 유도된 배양액 80 mL를 720 mL의 LB에 첨가하여 세포를 회복시킵니다. 0분부터 1시간까지 10분마다 정지 용액을 첨가하여 각 플라스크에서 박테리아 세포를 수확합니다.

4 °C에서 10,000 g로 15분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 조절 가능한 자동 피펫을 사용하여 펠렛을 남은 액체에 부드럽게 재현탁합니다. 현탁액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 13,000 g로 1분 동안 원심분리합니다.

잔여 상층액을 버리고 마이크로 튜브를 밀봉한 후, 펠릿을 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다. 각 냉동 펠릿에 TRIzol 1 mL를 첨가하고, 피펫팅을 통해 현탁액을 균질화합니다.