0 조회수 • 3:35 분 • August 31st, 2026
아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터와 호스트 유래 오염 물질이 포함된 여과된 세포 용해물로 시작합니다.
용해물을 헤파린 기반 친화성 컬럼에 통과시킵니다.
바이러스 캡시드 단백질은 음전하를 띤 헤파린 그룹에 정전기적으로 결합합니다.
결합되지 않은 오염물을 제거하기 위해 완충액으로 컬럼을 세척합니다.
막 잔해를 가용화하기 위해 계면활성제가 포함된 완충액을 처리합니다.
계면활성제가 포함되지 않은 완충액으로 다시 헹굽니다.
이온 환경을 조성하기 위해 양이온이 첨가된 버퍼를 주입한 다음, 중간 농도의 염 버퍼로 세척하여 약하게 결합된 불순물을 제거합니다.
캡시드-헤파린 상호작용을 저해하고 바이러스 입자를 용출시키기 위해 고농도 염 버퍼를 추가합니다.
온전한 바이러스 입자가 농축된 용출 분획을 수집하여 필터 막이 장착된 원심 분리 농축 튜브로 옮깁니다.
튜브를 원심분리하여 과량의 버퍼를 제거한 후, 농축된 바이러스 분획을 튜브에 수집합니다.
잔류 바이러스 입자를 회수하고 수율을 극대화하기 위해 버퍼로 멤브레인을 헹굽니다.
조제된 용해물을 4°C에서 하룻밤 동안 해동하십시오.
해동 후 0.22 micron 필터를 사용하여 여과하십시오. 정제 단계 직전에, 사용되는 heparin-Sepharose 컬럼당 4 mL의 필터 전처리 버퍼를 첨가하여 원심 농축기를 패시베이션하십시오. 튜빙을 연동 펌프에 거치하십시오.
용액과 배지를 순차적으로 주입합니다. 5 mL heparin-Sepharose 컬럼을 튜브에 연결하고 25 mL Bazell DMEM을 컬럼에 통과시켜 크로마토그래피를 준비합니다. 그런 다음 필터링된 조추출물(crude lysate) 0.2 µM을 초당 1~2방울의 유속으로 컬럼에 로딩합니다.
300 mM sodium chloride가 포함된 HBSS(magnesium 및 calcium 포함)로 5 mL씩 5회 순차적으로 컬럼을 세척하여 용리시키고, 5개의 용리액을 E1에서 E5까지 표시합니다. 준비가 되면, 전처리 완충액이 들어있는 원심분리 농축기를 900 ×g에서 2분간 원심분리합니다. 통과액은 버립니다. 원심분리 농축기 필터를 magnesium 및 calcium이 포함된 HBSS 4 mL로 1000 ×g에서 2분간 원심분리하여 세척합니다.
그 다음 용출액 E2를 원심분리 농축기에 넣고 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 통과액은 버립니다. 마찬가지로 농축된 바이러스의 부피가 약 1 mL가 될 때까지 용출액 E3를 원심분리 농축기에 넣고 원심분리합니다.
P200 필터 팁을 사용하여 원심분리 농축기에서 농축된 바이러스를 제거하고, 이를 멸균된 1.5 milliliter 원심분리 튜브에 수집합니다. 바이러스를 수집한 후, 마그네슘과 칼슘이 포함된 HBSS 200 microliters로 원심분리 농축기를 헹굽니다. 30초 동안 강하게 피펫팅하여 막에 부착된 바이러스를 모두 떼어내고, 이 농축된 바이러스를 동일한 1.5 milliliter 원심분리 튜브에 수집합니다.
튜브를 잘 섞어줍니다.