렌티바이러스 벡터 기반의 쥐 수정 배아 형질도입

증발을 방지하기 위해 미네랄 오일로 덮여 있고 중앙에 배아 배양 배지 한 방울이 들어 있는 미세주입 접시를 준비합니다.

디쉬를 도립 현미경 아래에 놓습니다.

현미경 하에서 마이크로조작기 장치에 미세주입 모세관과 홀딩 피펫을 배치합니다.

미세주입 모세관에 외래 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터 현탁액을 충전합니다.

그런 다음, 수정된 쥐 배아를 배지로 옮깁니다.

흡입력을 이용하여 홀딩 피펫으로 배아를 고정합니다.

더 높은 배율에서, 배아의 세포외 당단백질 층인 투명대(zona pellucida)를 통해 미세주입 모세관을 삽입하고, 렌티바이러스 현탁액을 난주위강(perivitelline space)에 주입하십시오.

그 후, 주입된 배아를 배양 접시로 옮겨 배양합니다.

바이러스가 배아 내부로 진입하여 트랜스진을 포함하는 게놈을 세포질로 방출합니다.

이후, 이는 DNA로 역전사되어 배아의 게놈에 통합되며, 이로써 외래유전자가 삽입됩니다.

형질전환된 배아는 이제 처리 준비가 완료되었습니다.

1세포기 배아의 투명대 하부 렌티바이러스 벡터 미세주입을 위해, 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 필라멘트가 포함된 미세주입용 붕규산 유리 모세관을 준비하십시오. 필라멘트를 교체하거나 새로운 유리 모세관을 사용할 때마다 램프 테스트(Ramp test)를 수행하여 최적의 파라미터를 설정하십시오.

다음으로, 생물안전 층류 후드(biosafety laminar flow hood) 아래에서 마이크로더 팁을 사용하여 각 미세주입 파이펫에 갓 해동한 렌티바이러스 용액 약 2 µL를 충전합니다. 60 mm 페트리 접시의 뚜껑 중앙에 M2 배지 10 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 배지 위에 미네랄 오일을 덮고, 홀딩 파이펫과 바이러스가 충전된 미세주입 모세관을 마이크로매니퓰레이터에 장착합니다.

마이크로인젝션 디쉬를 도립 현미경 아래에 두고, 15~20개의 1세포기 배아를 마이크로인젝션 디쉬 내의 M2 드롭으로 옮깁니다. 홀딩 피펫으로 배아 하나를 잡고, 40배 배율에서 유리 모세관을 사용하여 렌티바이러스 용액을 투명대 아래의 난구강 내로 주입하며, 바이러스가 전달된 후 모세관을 투명대 아래에 잠시 유지합니다. 모든 배아에 주입이 완료되면, 미세 피펫을 사용하여 주입된 세포들을 배양 접시로 옮기고, 착상 전까지 세포 배양 인큐베이터에 접시를 다시 넣습니다.