0 조회수 • 3:45 분 • August 31st, 2026
폴리히스티딘 태그가 부착된 바이러스 인테그라제를 발현하는 박테리아 세포 현탁액으로 시작합니다.
현탁액을 초음파 처리하여 박테리아 세포막을 파쇄하고 인테그라제를 방출시킵니다.
용해물을 초원심분리관으로 옮깁니다.
고속 원심분리를 통해 세포 파쇄물을 펠렛으로 가라앉히고 상층액을 수집한다.
다음으로, 니켈 충전 레진이 충진된 크로마토그래피 컬럼을 준비하고 버퍼로 평형화합니다.
정제된 용해물을 컬럼에 로딩합니다.
히스티딘을 포함하는 단백질은 니켈에 약하게 결합하는 반면, 폴리히스티딘 태그가 붙은 인테그레이스는 강하게 결합합니다.
완충액으로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거한 다음, 이미다졸 농도를 선형적으로 증가시킨 용출 완충액을 첨가하십시오.
Imidazole는 히스티딘과 니켈 결합을 위해 경쟁하여 인테그라제를 방출시킵니다.
분획물을 수집하고 일정량을 로딩 버퍼가 들어 있는 튜브로 옮깁니다.
단백질을 변성시키기 위해 가열한 후, 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하십시오.
전기영동을 수행하고 단백질 밴드를 분석하십시오.
오염 단백질 없이 순수한 integrase를 포함하는 분획을 식별하고, 이를 모아 정제된 바이러스 integrase를 얻습니다.
먼저 prototype foamy virus integrase를 발현하는 E.coli 펠렛 하나를 얼음 위에서 해동합니다. 0.5인치 직경의 바이오 혼과 0.125인치 직경의 테이퍼드 마이크로팁이 장착된 초음파 분쇄기를 사용하여, 튜브를 얼음 위에 둔 상태에서 30% 진폭으로 30초 동안 초음파 분쇄합니다. 초음파 분쇄 후, 세포 샘플을 차가운 초원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 120,000 x g로 60분 동안 원심분리합니다.
원심분리 후, 명확한 펠렛이 형성되어야 하며 상층액은 노란색을 띨 수 있습니다. 상층액을 차가운 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 1.5 mL의 니켈 충전 레진을 사용하여 길이 110 mm, 직경 5 mm의 FPLC 컬럼을 준비합니다.
먼저 컬럼을 FPLC 장비에 연결하고 버퍼를 주입합니다. 장비는 전도도와 280 nm에서의 UV 흡광도 데이터를 실시간으로 수집해야 합니다. 전도도와 UV 수치는 안정화되어야 합니다.
필요한 경우, 측정값이 안정될 때까지 컬럼에 버퍼를 계속 흘려줍니다. superloop를 사용하여, 0.15 mL/min의 유속과 0.5 MPa의 최대 압력 제한으로 단백질 샘플을 컬럼에 로딩합니다. superloop를 AKTA FPLC에 연결하십시오.
컬럼을 세척하고 단백질을 용출시킨 후, 초기 통과액(flowthrough), 세척액 및 280nm 흡광도 피크 분획에서 15 μL씩 분취하여 각 시료에 2X SDS-PAGE 샘플 버퍼 15 μL를 첨가합니다. 시료를 3분 동안 가열합니다. 각 시료 10 μL와 미리 염색된 단백질 표준물질 4 μL를 10% SDS-PAGE 겔에 로딩합니다.
겔을 시각적으로 확인하여 거의 순수한 prototype foamy virus integrase를 포함하고 있는 것으로 보이는 분획들을 식별합니다. 이 분획들을 하나로 합치고, 피펫팅하는 동안 부피를 기록합니다. 이는 일반적으로 8~10 mL입니다.