헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용한 바이러스 인테그라제 정제

불순물로 잔류 박테리아 뉴클레아제가 포함된 정제된 바이러스 인테그레이즈 효소 분획물을 사용하여 시작합니다.

저염 결합 버퍼로 미리 평형화한 heparin-Sepharose 컬럼에 샘플을 로딩합니다.

혼합물이 컬럼을 통과할 때, 인테그라아제는 오염된 뉴클레아제보다 헤파린 리간드에 더 강하게 결합합니다.

다음으로, 컬럼을 통과하는 완충액의 염 농도를 점진적으로 높입니다.

낮은 염 농도에서는 약하게 결합된 뉴클레아제가 먼저 용출되며, 강하게 결합된 인테그라제는 더 높은 염 농도에서 나중에 용출됩니다.

오염된 뉴클레아제를 인테그라제로부터 분리하기 위해 용출된 분획들을 개별적으로 수집하십시오.

각 분획에 SDS-PAGE 샘플 버퍼를 추가하고 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로딩하고 전기영동 분리를 수행합니다.

염색된 겔을 관찰하십시오.

눈에 띄는 오염 단백질 없이 뚜렷한 인테그라제 밴드가 포함된 분획을 확인하여 겉보기 순도를 판별합니다.

프로토타입 거품 바이러스 인테그라제의 헤파린 친화성 크로마토그래피 분획을 수행하려면, 버퍼 C를 1.5배 부피로 첨가하여 시료의 염화나트륨 농도를 200밀리몰라(mM)로 낮춥니다. 그다음, 희석된 프로토타입 거품 바이러스 인테그라제 시료를 최대 압력 제한 1메가파스칼(MPa), 유속 분당 0.5밀리리터(mL/min)로 헤파린 Sepharose 컬럼에 로딩합니다. 컬럼을 세척하고 그래디언트 및 최종 세척액을 수집한 후, 로딩 시료, 통과액, 세척액 및 분획물을 8% SDS-PAGE로 분석합니다.

그 다음, 젤을 Coomassie blue로 염색하여 분획을 평가합니다. Prototype foamy virus integrase와 오염된 nuclease는 heparin Sepharose 크로마토그래피에 대해 서로 다른 친화력을 가집니다. nuclease 분석에 사용할, 거의 순수한 prototype foamy virus integrase가 포함된 것으로 보이는 heparin Sepharose 분획을 확인합니다.