플라크 분석법을 이용한 슈도바이러스 입자의 정량 분석

포유류 상피 세포가 포함된 멀티 웰 플레이트를 준비합니다.

코로나바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 슈도바이러스의 계열 희석액을 준비합니다.

각 웰의 배지를 희석된 바이러스 현탁액으로 교체합니다.

바이러스 스파이크 단백질이 숙주 세포 수용체에 결합할 수 있도록 가끔 흔들어주며 배양하십시오.

배지를 제거한다. 바이러스의 확산을 제한하는 반고체 오버레이를 형성하기 위해 메틸셀룰로오스가 포함된 배지를 첨가하고 배양한다.

바이러스가 세포 내로 진입하여 RNA 게놈을 방출합니다.

RNA는 새로운 바이러스 RNA와 단백질의 합성을 유도하며, 이들은 바이러스 입자로 조립되어 세포 밖으로 배출됩니다.

방출된 바이러스는 인접한 세포들을 감염시켜 플라크(plaque)라고 불리는 투명한 구역을 형성합니다.

오버레이를 제거하고 세포를 세척합니다.

염색약을 첨가하고 플레이트를 흔들어주며 배양합니다.

웰을 세척하고 건조합니다.

염색약이 세포를 염색하는 동안 플라크는 투명한 상태로 남습니다.

각 웰에서 관찰되는 플라크 수를 세어 바이러스 농도를 결정합니다.

바이러스 역가를 결정하기 위해, Vero E6 세포를 6-well 플레이트에 웰당 6 × 10⁵ cells의 파종 밀도로 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 7개의 마이크로 원심분리 튜브에 900 µL의 배지를 넣고 첫 번째 튜브에 100 µL의 바이러스 스톡을 첨가하여 바이러스 스톡의 10배 단계 희석 시리즈를 준비합니다. 짧게 vortexing한 후, 희석된 바이러스 100 µL를 다음 튜브로 순차적으로 옮기며 튜브마다 vortexing합니다. 그 후, Vero E6 배양 플레이트의 각 웰에 있는 상층액을 10⁻²에서 10⁻⁷까지 희석된 바이러스액 500 µL로 교체합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 15분마다 가볍게 흔들어주며 45분 동안 배양한 후, 접종액을 오버레이 용액으로 교체하고 34 °C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 플라크를 시각화하기 위해, 각 웰에 0.1% 크리스탈 바이올렛 2 mL를 넣기 전 세포를 PBS로 1회 세척합니다. 플레이트를 쉐이커에 올려 상온에서 약 20분 동안 둔 다음, 각 웰을 PBS로 2회 가볍게 세척합니다.

마지막 세척 후, 플레이트를 최소 1시간 동안 공기 건조시킨 다음, 명시된 공식을 사용하여 각 웰의 바이러스 역가를 밀리리터당 플라크 형성 단위(plaque forming units per