환자 혈청을 이용한 코로나바이러스 스파이크 단백질 발현 슈도바이러스의 항체 매개 중화 반응

시험 웰에 코로나바이러스 특이적 항체를 포함하는 열불활성화된 환자 혈청이 담긴 멀티웰 플레이트를 준비합니다. 대조군으로 건강한 사람의 혈청을 포함시키십시오.

코로나바이러스 스파이크 단백질을 발현하고 녹색 형광 단백질 인코딩 RNA를 보유한 슈도바이러스를 혈청 샘플에 첨가하고 배양합니다.

테스트 웰에서는 항체가 스파이크 단백질에 결합하여 슈도바이러스를 중화시키는 반면, 대조군 웰에서는 비특이적 항체가 스파이크 단백질에 결합하지 않아 슈도바이러스가 결합되지 않은 상태로 남게 됩니다.

혼합물을 상피세포 단층에 첨가합니다. 바이러스 흡착을 위해 배양합니다.

바이러스 확산을 제한하기 위해 각 웰에 반고체 오버레이 배지를 추가합니다. 배양합니다.

대조군에서는 결합되지 않은 가상 바이러스가 세포 수용체에 결합하여 세포 내로 진입하고, RNA를 방출하며 GFP를 발현함으로써 형광 감염 초점을 형성합니다.

테스트 웰에서 항체에 의해 중화된 가성 바이러스는 세포 내로 진입하지 못하여 감염 포커스 형성이 억제됩니다.

형광 이미저를 사용하여 형광 감염 포커스(foci)의 수를 측정하십시오.

대조군에서는 수많은 포커스가 관찰되는 것과 비교하여, 테스트 웰에서 감염 포커스가 나타나지 않는 것은 환자 혈청에 의한 슈도바이러스의 항체 매개 중화를 확인시켜 줍니다.

중화 분석을 위해 세포를 플레이팅하려면, 멀티채널 파이펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 2 × 10⁵ cells/mL 밀도로 Vero E6 세포 100 µL를 분주하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 테스트할 환자 혈청 샘플을 56 °C 항온수조에서 30분 동안 가열 불활성화합니다.

그 다음, 빈 96-well 조직 배양 플레이트의 row A 각 웰에 항생제가 포함된 무혈청 DMEM 72 µL와 환자 혈청 샘플 8 µL를 첨가하여 혈청 샘플의 10배 희석 시리즈를 설정합니다. 이어서 row B부터 G의 각 웰에는 무혈청 DMEM 40 µL를, row H의 각 웰에는 80 µL를 첨가합니다. 12-well 멀티채널 피펫을 사용하여 row A의 샘플들을 혼합한 후, row A의 각 웰에서 row B의 각 웰로 샘플 40 µL를 옮깁니다. 혼합 후, row F까지 각 다음 행의 웰에 대해 희석 과정을 반복합니다. 다음으로, row A부터 G의 각 웰에 0.05 multiplicity of infection 농도의 VSV spike EGFP 40 µL를