형광 리포터를 이용한 백시니아 바이러스의 단계별 유전자 발현 모니터링

재조합 백시니아 바이러스에 노출된 포유류 세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 준비합니다.

재조합 바이러스는 각각의 단계 특이적 프로모터에 의해 제어되는 녹색, 적색 및 청색 형광 단백질을 인코딩하여, 유전자 발현의 초기, 중간 및 후기 단계를 각각 추적합니다.

바이러스는 수용체 매개 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis)를 통해 세포 내로 진입하며, 세포질로 바이러스 코어를 방출합니다.

바이러스 코어의 전사 기전은 녹색 형광으로 표시되는 초기 유전자 발현을 유도합니다.

초기 단백질은 게놈의 외피 제거(uncoating)를 매개하여 바이러스 DNA를 세포질로 방출하며, 이곳에서 DNA polymerase가 바이러스 게놈을 복제합니다.

다음으로, 적색 형광으로 나타나는 중간 유전자 발현은 후기 유전자를 활성화하는 데 필수적인 전사 인자를 생성합니다.

그 후, 청색 형광으로 표시되는 후기 유전자 발현을 통해 성숙한 비리온 형성에 필요한 구조 단백질이 생성됩니다.

형광을 보존하기 위해 고정액을 첨가하고 짧은 시간 동안 배양합니다.

고정액을 제거한 후, 버퍼를 추가합니다.

분광광도계를 사용하여 형광을 측정하고, 감염된 세포 내의 단계별 바이러스 유전자 발현량을 정량화합니다.

10 cm 디쉬에서 배양한 HeLa 세포를 분리하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 세포를 성장 배지에 희석하여 약 2.0 x 10⁵ cells/ml가 되도록 합니다. 그다음, 검은색 벽과 투명한 평평한 바닥을 가진 96-well 플레이트의 각 웰에 100 μl씩 분주합니다. 37 °C, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 합쳐질(confluent) 때까지 24시간 동안 배양합니다. 바이러스를 희석하기 위해 TrpV와 PLV를 37 °C 항온수조에서 해동한 다음, 5분 동안 초음파 처리(sonicate)하여 응집을 해제합니다. 이어서, 37 °C로 예열한 감염 배지에 바이러스 스톡을 1.0 x 10⁷ PFU/ml가 되도록 희석합니다.

세포를 감염시키기 위해 각 웰의 성장 배지를 50 µL의 희석된 바이러스로 교체합니다. 각 처리군당 3개의 반복 웰에는 TrpV를, 다른 3개의 반복 웰에는 PLV를 감염시켜 각 처리에 따른 배경 형광을 보정합니다. 37 °C 인큐베이터(5% CO2 포함)에서 18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 웰의 감염 배지에 8% paraformaldehyde 100 µL를 첨가하여 세포를 고정합니다. 플레이트를 빛이 차단된