감염된 곤충 체내 바이러스의 분리 및 정제

킬레이트제(chelating agent)가 포함된 완충액에 현탁된 바이러스 감염 곤충의 체부를 준비합니다.

곤충 조직을 파쇄하여 바이러스 입자와 반응성 금속 이온을 포함한 세포 내 성분들을 방출시키기 위해 균질화합니다.

킬레이트제는 금속 이온과 결합하여 활성 산소종의 형성을 방지하고, 바이러스 입자를 산화적 손상으로부터 보호합니다.

초원심분리기를 사용하여 바이러스와 불용성 잔해물을 침전시킨 후, 상층액을 제거합니다.

염과 계면활성제가 포함된 완충액을 첨가한 후, 반복적인 피펫팅을 통해 펠렛을 재현탁합니다. 계면활성제는 지질이 풍부한 잔해물을 용해시켜 결합된 바이러스 입자를 방출시킵니다.

원심분리하여 불용성 잔해물을 침전시킵니다. 바이러스 입자가 포함된 상층액을 수집합니다.

상층액을 여과하여 잔여 파편을 제거하고 바이러스가 포함된 여과액을 수집합니다.

과잉의 계면활성제와 완충염을 제거하기 위해 여과액을 저온의 물에서 투석합니다.

바이러스 입자가 침전될 때까지 주기적으로 물을 교체하십시오. 이제 바이러스를 다음 단계에 사용할 수 있습니다.

바이러스 양성 H. vitripennis의 전체 몸체를 0.02% DETCA가 포함된 인산염 완충액에 넣고, 조직의 큰 덩어리가 더 이상 남아 있지 않을 때까지 약 10초 간격으로 볼텍싱하여 균질화합니다. 4 °C에서 22,000 g로 16시간 동안 초고속 원심분리를 수행하여 바이러스를 추출합니다.

상층액을 버린 후, 펠릿을 수집하고 0.4% sodium deoxycholic acid와 4% polyethylene glycol hexadecyl ether가 포함된 10 mM 인산 완충액 5 ml로 용해합니다. 펠릿을 잘 혼합하기 위해 필요한 경우 튜브 벽면에서 펠릿을 떼어내어 으깹니다. 300 x g에서 15분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 용액을 0.45 μm 필터에 통과시켜 여과액을 대형 수집 튜브에 수집합니다.

필요한 경우 DETCA가 포함되지 않은 10 mM 인산 완충액을 소량 사용하여 여과액을 분자량 컷오프(MWCO)가 3.5 kD인 투석 막으로 옮깁니다. 투석 막을 4 °C의 2차 증류수가 채워진 커다란 비커에 넣습니다. 막 내에 흰색 침전물이 형성될 때까지 5~6시간 동안 매시간 증류수를 교체합니다.