포유동물 세포 내 재조합 렌티바이러스 생성

저혈청 배지에서 배양된 포유류 세포로 시작합니다.

DNA-지질 복합체를 세포에 첨가합니다.

이 복합체는 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 표적 유전자를 인코딩하는 발현 플라스미드를 포함합니다.

복합체가 세포 내로 진입할 수 있도록 배양합니다.

잔류 트랜스펙션 시약을 제거하기 위해 배지를 교체하고 배양합니다.

세포 내부에서 플라스미드 DNA는 핵으로 들어가 목적 유전자를 포함하는 바이러스 RNA와 캡시드 및 외피 단백질, 역전사 효소, 인테그레이스를 포함한 바이러스 구성 요소의 합성을 유도합니다.

이러한 구성 요소들은 재조합 렌티바이러스 입자로 조립되어 숙주 세포막으로부터 출아합니다.

방출된 바이러스 입자가 포함된 배지를 수집합니다.

원심분리하여 세포 부스러기를 침전시키고, 바이러스 상층액을 여과하여 잔류 오염 물질을 제거합니다.

고속 원심분리하여 온전한 바이러스 입자를 펠릿화합니다.

상층액을 버리고 신선한 배지 소량으로 바이러스 펠렛을 재부유시킨다.

농축된 재조합 렌티바이러스를 저온에 보관하여 후속 실험에 사용하십시오.

농축된 렌티바이러스를 생산하기 위해, 1.5 × 10⁶개의 HEK-293T 세포를 60 mm 디시에 분주하고, 5% CO₂가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터에서 일반 배지로 배양합니다. 24시간 배양 후 HEK-293T 세포가 80~90%의 합류도(confluency)에 도달하면, 배지를 3.5 mL의 DMEM으로 교체한 다음 5% CO₂가 포함된 37 °C 습윤 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 세포를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 배지를 2% FBS가 포함된 DMEM으로 교체하고, 새로 준비한 트랜스펙션 복합체 혼합물을 세포에 한 방울씩 첨가합니다.

액체 혼합물을 부드럽게 섞어줍니다. 8시간이 지나면 세포 배지를 3.5 mL의 일반 배지로 교체합니다. 24시간과 48시간 후에 바이러스 상층액을 수집합니다.

다음으로, 서로 다른 두 시점에서 수집한 바이러스 상청액을 혼합하고 4 °C에서 200 × g로 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후, 수집된 상청액을 0.45 µm 필터에 통과시켜 여과액을 50 mL 멸균 원추형 튜브에 수집합니다. 여과된 바이러스 상청액을 4 °C에서 6,000 × g로 하룻밤 동안 원심 분리하여 농축합니다.

완료 후, 원심분리관 바닥에 바이러스 펠렛이 보이는지 확인하십시오. 상층액을 천천히 따라내십시오. 바이러스 상층액 부피의 1/100에 해당하는 일반 배지로 바이러스 펠렛을 용해시키기 위해, P