microRNA mimic 매개 게놈 साइ런싱을 통한 바이러스 확산 억제 평가

인간 상피 유사 세포로 시작합니다.

첫 번째 웰에는 transfection을 하지 않은 세포가 포함되어 있으며, 두 번째 웰에는 microRNA mimic이 transfection된 세포가 포함되어 있습니다.

형질전환된 세포에서, microRNA mimic 가닥은 단백질 복합체와 결합하여 RNA 유도 침묵 복합체를 형성합니다.

배지를 제거하고 바이러스 현탁액을 첨가합니다.

바이러스가 부착될 수 있도록 배양합니다.

배지를 제거하고 새 배지를 추가한 후 배양합니다.

형질전환되지 않은 세포에서 바이러스는 수용체 매개 엔도사이토시스를 통해 세포 내부로 진입합니다.

이는 바이러스 게놈을 방출하며, 방출된 게놈은 복제되어 많은 수의 바이러스 입자를 생성합니다.

형질전환된 세포에서 RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex)가 바이러스 게놈을 인식하여 분해를 유도하고 바이러스 생산을 감소시킵니다.

새로운 바이러스가 방출됩니다. 바이러스가 포함된 배지를 옮깁니다.

원심 분리하여 잔해물을 침전시키고 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다.

상청액을 transfection되지 않은 세포에 첨가하십시오. 바이러스 감염을 위해 배양하십시오.

비전이(non-transfected) 세포 상청액으로 처리한 웰은 microRNA mimic이 전이된 세포 상청액으로 처리한 웰에 비해 더 높은 세포 사멸을 나타내며, 이는 microRNA에 의한 바이러스 복제 억제를 확인시켜 줍니다.

이 단계에서는 transfection 시점에 세포 밀도가 80~90%가 되도록 허용 세포를 96-well 조직 배양 플레이트에 분주합니다. 그런 다음 transfection 시약을 실온으로 가온합니다. 각 well당 9 µL의 무혈청 배지, 200 nM의 microRNA mimic 스톡, 0.18 µL의 boost reagent, 0.18 µL의 transfection 시약을 혼합하여 마스터 믹스를 제조하고 섞어줍니다.

혼합물을 실온에서 2~5분 동안 배양합니다. 그 후, 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 92 µL의 신선한 완전 배지를 추가합니다. 그런 다음, 적절한 부피의 transfection 혼합물을 세포에 한 방울씩 떨어뜨려 추가하고, 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다.

필요한 경우, transfection 효율을 높이기 위해 감염 전 24시간 동안 microRNA mimic transfection 상태로 배양할 수 있습니다.

다음으로, 무혈청 배