리포터 포함 에볼라 바이러스 전사 및 복제 가능 바이러스 유사 입자의 생산

에볼라 바이러스 게놈을 모사하며 바이러스 구조 단백질, 당단백질 및 루시퍼라제 리포터를 인코딩하는 미니게놈 플라스미드로부터 시작합니다.

T7 polymerase, 바이러스 뉴클레오단백질, 그리고 복제와 전사에 필수적인 바이러스 폴리머라제 성분을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드를 첨가하십시오.

플라스미드에 지질 기반의 트랜스펙션 시약을 첨가하고, 볼텍싱한 후, 혼합물을 배양하여 플라스미드-지질 복합체를 형성합니다.

이 혼합물을 인간 신장 세포에 첨가하고, 부드럽게 섞은 후 배양하십시오.

지질 복합체가 세포와 융합됩니다. 플라스미드가 세포 내로 진입합니다.

헬퍼 플라스미드는 각각의 단백질을 인코딩합니다.

이후 T7 polymerase가 미니게놈을 바이러스 게놈 RNA로 전사하며, 이는 즉시 뉴클레오단백질로 코팅됩니다.

바이러스 폴리머라아제 복합체는 바이러스 게놈 RNA에 결합하여 이를 바이러스 mRNA로 전사합니다. 이 mRNA들은 바이러스 구조 단백질과 당단백질을 생성합니다.

바이러스 단백질들이 조립되어 루시페라제 리포터 유전자를 포함하며 병원성이 없는 전사 및 복제 가능 바이러스 유사 입자(trVLPs)를 형성합니다.

세포 생존력을 유지하고 trVLP 생산을 지원하기 위해 신선한 배지로 교체합니다.

TRVLPs 생산에 필요한 플라스미드를 세포에 트랜스펙션합니다. BSC 내에서 필터 팁을 사용하여 DNA를 튜브에 피펫팅합니다. 음성 대조군으로 한 웰에서는 바이러스 폴리머라제 L을 인코딩하는 플라스미드를 제외하고, 대신 트랜스펙션 효율을 시각화하기 위해 GFP를 인코딩하는 플라스미드를 트랜스펙션할 수 있습니다. 그 다음, DNA에 웰당 100 microliters optimum을 첨가합니다. 튜브를 볼텍싱하고 원심 분리하여 가라앉힙니다.

다음으로, 희석된 DNA에 7.5 µL의 Transit LT1 transfection 시약을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 vortexing하고 상온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 피펫팅을 통해 transfection 혼합물을 부드럽게 섞은 다음, 6-well plate의 각 웰에 100 µL씩 방울방울 떨어뜨려 추가합니다.

세포에 transfection complex를 첨가한 후, 플레이트를 앞뒤와 좌우로 흔들어 줍니다. 플레이트를 회전시키듯 흔들면 transfection이 불균일하게 일어날 수 있으므로 주의하십시오. 그 후 세포를 인큐베이터로 옮깁니다. transfection 24시간 후에 세포