인간 배아 신장 세포 내 항바이러스 화합물 평가를 위한 루시페라아제 기반 분석법

항바이러스 활성을 평가하기 위해 테스트 화합물의 연속 희석액이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작하십시오.

루시퍼레이즈를 발현하는 재조합 홍역 바이러스가 포함된 인간 배아 신장 세포 현탁액을 각 웰에 첨가합니다.

세포가 각 웰의 바닥에 부착되도록 배양합니다.

시험 화합물이 없는 대조군 웰에서 바이러스는 세포막과 융합하여 게놈을 세포질로 방출합니다.

바이러스 게놈은 리포터 단백질인 luciferase와 더불어 바이러스 RNA 및 단백질의 생성을 지시합니다.

테스트 웰에서 항바이러스 화합물이 바이러스 복제를 억제하여 루시퍼레이스 생성이 감소합니다.

각 웰에 루시퍼레이즈 특이적 기질을 첨가하면, 이것이 루시퍼레이즈와 상호작용하여 발광을 나타냅니다.

플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 발광 강도를 측정합니다.

대조군 웰에 비해 시험 웰의 발광 수치가 낮으면 바이러스 억제가 일어난 것을 나타냅니다.

화합물 농도가 증가함에 따라 발광이 점진적으로 감소하는 것은 바이러스 복제의 농도 의존적 억제를 나타냅니다.

화합물 희석 플레이트에서 1 µL를 취해 흰색 바코드 조직 배양 플레이트에 추가합니다. 이 과정을 두 번 반복하여 테스트 플레이트 3세트를 만듭니다. 그런 다음 조직 배양 플레이트에 50 µL의 배양액을 채웁니다. 이제 보충된 DMEM에 600,000 cells/ml 농도로 현탁된 HEK-293T 세포 37.5 ml를 준비합니다.

두 개의 15ml 튜브에 세포 현탁액을 각각 12.5ml씩 넣습니다. 세포가 든 튜브 하나에 rMV2/luc를 감염 다중도(MOI) 0.1로 감염시킵니다. 이제 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 세트를 각각의 HIT 화합물 플레이트에 넣습니다.

웰당 50 µL의 세포를 분주하고 플레이트를 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, rMV2/luc 감염 세포가 담긴 각 웰에 50 µL의 firefly luciferase 기질을 첨가합니다. 비감염 대조군 세포에는 50 µL의 luciferase 기반 세포 생존력 측정 시약을 첨가합니다.