아메바를 이용한 혼합 바이러스 집단으로부터 단일 거대 바이러스의 분리

오염을 방지하기 위해 항균제가 포함된 기아 배지(starvation medium)에서 배양한 아메바를 준비합니다. 아메바는 거대 바이러스의 감수성 숙주 역할을 합니다.

두 종류의 거대 바이러스 혼합 집단이 포함된 희석된 바이러스 현탁액을 첨가합니다.

배지의 증발을 방지하기 위해 배양 접시를 봉투에 넣고 배양합니다.

바이러스 희석은 각 아메바가 단일 종류의 거대 바이러스와 조우할 가능성을 높여줍니다.

아메바가 바이러스를 포식하면 바이러스가 세포 내에서 복제되며, 이로 인해 감염된 세포가 둥글게 변하고 탈락하면서 세포병변효과를 일으킵니다.

광학 현미경으로 배양 상태를 관찰하여 세포병성 효과 징후를 확인하십시오.

그 다음, 디쉬를 도립 현미경 스테이지 위로 옮깁니다.

도립 현미경 아래의 마이크로 매니퓰레이터에 마이크로모세관을 배치합니다. 마이크로모세관에는 세포 흡입을 정밀하게 조절하기 위한 생체 적합성 미네랄 오일이 들어 있습니다.

마이크로모세관을 사용하여 감염된 둥근 단일 세포를 조심스럽게 흡입한 다음, 이를 새로운 아메바 배양액에 방출합니다. 이후 배양합니다.

감염된 세포 내에 축적된 바이러스 자손들은 엑소사이토시스(exocytosis)를 통해 방출되어 주변 세포들을 감염시키며 확산되고, 이를 통해 단일 거대 바이러스 집단이 증식하게 됩니다.

기아 배지(starvation medium)를 사용하여 바이러스 샘플의 연속 희석을 서로 다른 웰에서 수행합니다. 각 페트리 접시에 담긴 1 $\times$ 10⁶ Vermamoeba vermaformis 2 mL에 혼합 접종액 100 $\mu$L를 접종합니다.

그 다음, 페트리 접시를 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣어 30 °C에서 보관합니다. 감염 6시간 후, 도립 광학 현미경으로 페트리 접시를 관찰하고 4~8시간마다 세포 형태를 확인합니다. 항균 처리 단계는 세포 지지물을 위한 것입니다.

페트리 접시 중에서 곰팡이 및 박테리아 오염이 보이지 않으며, 바이러스로 인한 아메바의 세포병적 효과(cytopathic effect)가 나타나고, 바이러스 입자의 흡입을 방지하기 위해 아메바의 사전 용해 및 원형화 단계가 확인되는 접시를 선택하십시오. 마이크로매니퓰레이터, 수동 압력 제어 장치, 도립 현미경, Plug and Play 모터 모듈, 카메라 및 컴퓨터 모듈이 갖춰진 작업대를 설정하십시오. 내부 위치를 유지하고 세포를 쉽게 방출할 수 있도록 내경 20 micron의 마이크로 모세관을 선택하십시오