면역 자극 단백질을 인코딩하는 재조합 홍역 바이러스의 생성

재조합 홍역 바이러스 안티게놈 플라스미드와 필수 바이러스 단백질을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드를 캡슐화한 리포좀 현탁액으로 시작합니다.

안티게놈 플라스미드는 감염된 세포에서 면역 자극 단백질과 형광 리포터를 발현하도록 수정된 홍역 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고 있습니다.

오염을 방지하기 위해 항생제가 포함된 바이러스 생산 세포 배양액을 준비합니다.

리포좀 현탁액을 배양액에 넣고 배양합니다.

리포좀이 세포막과 융합되어 플라스미드를 전달합니다.

숙주 세포 기전이 안티게놈 cDNA를 RNA로, 헬퍼 플라스미드를 mRNA로 전사하여 단백질 발현과 바이러스 복제 복합체의 형성을 가능하게 합니다. 이 복합체는 게놈 RNA를 생성하며, 이를 통해 바이러스 단백질 발현이 이루어집니다.

게놈 RNA가 바이러스 단백질과 결합하여 재조합 바이러스 입자를 생성합니다.

감염된 세포는 현미경 관찰을 위한 형광 리포터 단백질을 발현하며, 바이러스에 의해 인코딩된 면역 자극 단백질을 생성합니다.

감염된 세포는 홍역의 세포병성 효과의 특징인 다핵성 융합세포(syncytia)를 형성합니다.

형광 현미경을 사용하여 크기가 큰 형광성 합포체(syncytia)를 확인함으로써 재조합 바이러스의 성공적인 복구가 이루어졌는지 검증하십시오.

cDNA로부터 홍역 바이러스를 복원하기 위해, 트랜스펙션 24시간 전에 홍역 바이러스 생산 세포를 6-웰 플레이트에 균일하게 도말합니다.

트랜스펙션 시점에 65~75%의 합류도(confluency)에 도달하도록 웰당 10% FBS가 포함된 2 milliliters DMEM에 200,000개의 세포를 분주합니다. 세포 트랜스펙션에 사용할 홍역 바이러스 안티게놈을 인코딩하는 5 micrograms의 재조합 DNA, 적절한 플라스미드 및 형광 리포터를 200 microliters의 DMEM 총 부피로 혼합합니다.

혼합물에 18.6 µL의 리포좀 트랜스펙션 시약을 넣고 즉시 튜브를 튕겨 섞어줍니다. 이 트랜스펙션 혼합물을 상온에서 25분 동안 배양합니다. MV 생산 세포를 트랜스펙션하기 위해, 65~75% 밀도로 성장시킨 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고, 웰당 2% FBS와 50 µg/mL kanamycin이 포함된 DMEM 1.8 mL를 첨가합니다.

그런 다음 각 웰에 transfection 혼합물을 한 방울씩 첨가하고 조심스럽게 흔들어 섞어줍니다. 세포를 37 °C, 5 % CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 2 %