유전체 분석을 위한 개별 바이러스 입자의 형광 기반 분리

핵산을 결여한 결함 바이러스 입자와 같은 오염 물질이 포함된, 다양한 바이러스 혼합물이 함유된 현탁액을 준비합니다.

이 바이러스들은 게놈을 가진 바이러스와 오염물을 구별하기 위해 핵산 결합 형광 염료로 사전 염색되었습니다.

현탁액을 형광 활성 세포 분류기(FACS)에 통과시켜, 각 입자의 광산란 및 형광 강도를 분석합니다.

광산란 신호는 입자 크기를 반영하며, 형광 강도는 핵산 함량을 나타냅니다.

형광을 나타내지 않는 오염 물질과 비정상적으로 높은 형광을 보이는 응집체는 제외하십시오.

게놈을 포함하는 단일 바이러스 입자를 선택하여 고정을 위해 아가로스가 코팅된 챔버 슬라이드로 직접 분리하십시오.

각 웰 위에 추가적인 아가로스를 덮어 바이러스를 임베딩합니다.

이제 단일 바이러스 게놈 증폭 및 분석을 위한 준비가 완료되었습니다.

커스텀 전방 산란 광전자 증배관(FSC-PMT)이 장착된 유세포 분석기를 사용하여 바이러스를 분리하십시오. 먼저 0.1 μm 여과된 Tris-EDTA로 바이러스 입자를 희석합니다. T4 및 lambda 파지 입자가 포함된 혼합 군집의 경우, 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 FSC-PMT를 1000으로, SSC를 200으로 설정하십시오.

대조군 샘플을 실행한 후, 염색된 바이러스 현탁액 약 100 µl를 총 5,000 events가 될 때까지 실행합니다. 그런 다음 SYBR Green I 및 FSC-PMT 플롯을 사용하여 바이러스 입자의 중앙에 좁은 게이트(tight gate)를 설정합니다. 이제 37 °C로 냉각된 TBE 버퍼 내 1% 저융점 아가로스(low-melting-point agarose) 5 µl를 PTFE 현미경 슬라이드의 각 웰에 추가하고, 슬라이드를 유세포 분석기에 로드하여 분류된 바이러스 입자를 포집합니다.

분류를 시작하여, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy) 관찰 시 바이러스의 깊이 검출을 용이하게 하기 위해 일부 웰에 10개 이상의 바이러스 입자 이벤트를 캡처합니다. 분류가 완료되면 유세포 분석기에서 슬라이드를 제거하고, 37 °C로 냉각된 저융점 아가로스(low melting point agarose) 5 μL를 각 웰에 추가하여 바이러스 입자를 매립합니다.